Применение гена Fe-зависимой супероксиддисмутазы для защиты хлоропластов растений томата и табака от окислительного стресса

• Автор: Нодельман, Екатерина Константиновна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Негативное влияние абиотических стрессовых факторов на культурные растения

1.1.1 Неблагоприятное действие засоления и солевого стресса

1.1.2 Неблагоприятное действие окислительного стресса и активных форм кислорода

1.2 Получение растений устойчивых к неблагоприятным абиотическим факторам среды

1.2.1 Применение генов, кодирующих ферменты синтеза осмопротекторов

1.2.2 Применение генов, кодирующие LEA белки и пептиды (late embryogenesis abundant protein genes), синтезирующиеся на поздних стадиях эмбриогенеза
1.2.3 Применение генов, кодирующих сигнальные и регуляторные молекулы (белки, пептиды, РНК)
1.2.4 Применение генов, кодирующих ферменты, влияющие на количество, транспорт и восприятие рецепторами растительных гормонов
1.2.5 Применение генов участвующих в нейтрализации окислительного стресса
1.2.6 Применение генов, кодирующих, симпортеры, антипортеры, протонные помпы и транспортеры ионов
1.2.7 Применение генов, кодирующих молекулярные шапероны
1.3 Роль супероксиддисмутазы в регуляции активных форм кислорода
1.3.1 Структура, локализация и функции супероксиддисмутазы
1.3.2 Активность супероксиддисмутазы в условиях действия неблагоприятных факторов
1.4 Технология получение трансгенных растений семейства Solanaceae (табака и томата)
1.4.1 Использование метода биолистической трансформации
1.4.2 Использование метода электропорации
1.4.3 Использование метода микроинъекции ДНК
1.4.4 Использование метода агробактериальной трансформации
1.5 Стратегии повышения устойчивости томата к воздействию абиотических стрессов
1.6. Заключение по обзору литературы
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Растительный материал
2.2 Введение томата и табака в культуру in vitro
2.3 Конструкция для агробактериальной трансформации растений
2.4 Агробактериальная трансформация
2.5 Анализ наследования селективного гена npt II в первом трансгенном поколении табака и томата
2.6 Молекулярно - генетический анализ трансформантов
2.6.1 Экстракция бактериальной и плазмидной ДНК
2.6.2 Экстракция тотальной геномной ДНК растений
2.6.3 Полимеразная цепная реакция
2.6.4 Выделение РНК и обратная транскрипция
2.6.5 Электрофорез продуктов амплификации
2.7 Измерение активности антиокислительных ферментов
2.7.1 Получение грубых гомогенатов и ферментативных экстрактов
2.7.2 Определение активности ферментов
2.7.3 Анализ кислородного газообмена и переменной флуоресценции
2.8 Электронная микроскопия
2.9 Цитофотометрический анализ
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ЗЛ Агробактериальная трансформация и отбор генетически модифицированных растений
ЗЛ Л Изучение регенерационного потенциала томата сортов Белый
налив 241 и Взрыв
3 Л .2 Первичная оценка трансформантов
ЗЛ.З Молекулярно-генетический анализ канамицин - устойчивых побегов томата и табака
ЗЛ .4 Оценка эффективности агробактериальной трансформации
ЗЛ.5 Анализ экспрессии целевого гена Ре-БОВ 1 методом ОТ-ГТЦР
ЗЛ .6 Адаптация и выращивание в условиях защищенного грунта трансгенных растений томата и табака, экспрессирующих ген Ре-БОВ 1. Анализ семенного поколения
3 Л .7 Анализ экспрессии гена Ре-БОВ1 в первом семенном поколении Т1
3.2 Влияние экспрессии гена Ре-БОВ на анатомо-физиологические и биохимические характеристики растений табака и томата
3.2.1 Анализ активности ферментов трансгенных растений
3.2.2 Оценка митотической активности клеток трансгенных растений
3.2.3 Сравнительный анализ структурной организации хлоропластов в контрольных и трансгенных растениях
3.3 Влияние экспрессии гена Ре-БОВ 1 на анатомо-физиологические и биохимические характеристики растений томата в условиях стресса
3.3.1 Исследование активности фотосинтетического аппарата
3.3.2 Оценка цитофотометрических показателей трансгенных растений при солевом стрессе
3.3.3 Сравнительный анализ структурной организации хлоропластов в контрольных и трансгенных растениях при воздействии солей
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ

трансформации использовался зеатин [79, 207] или сочетание зеатина с ИУК [101, 253, 118, 186, 255]. Cortina и Culanez-MaciaT показали, что при использовании в качестве регулятора роста рибозида зеатина с ИУК частота регенерации составляет 23%, а при использовании зеатина с ИУК всего 6% [62]. Moghaieb с соавторами при агробактериальной трансформации сегментов гипокотиля томата добавляли в питательную среду 2,4 Д и кинетин, при этом частота регенерации составила 25-65% в зависимости от сорта [158].
Эффективность агробактериальной трансформации томата в зависимости от генотипа может изменяться в широком диапазоне. Например, у McCormick с соавторами эффективность трансформации составила - 70% растений, устойчивых к селективному агенту [152]. В исследовании Shahin эффективность составила 40-50% [224], в экспериментах Chyi - 75% устойчивых растений.
В более поздних работах эффективность трансформации оценивалась путем подсчета соотношения количества исходно кокультивированных с агробактерией эксплантов к количеству трансгенных регенерантов. Таким способом эффективность трансформации была подсчитана в экспериментальной работе Park с соавторами и составила 20% [186], а также в работах Sun - 28-48% [236] и Ни-25% [110].
Особое значение имеет концентрация агробактерий в суспензии для совместного кокультивирования с эксплантами. Влияние плотности бактериальной суспензии на эффективность трансформации было изучено в экспериментах Fillati с соавторами. Было показано, что когда концентрация бактерии увеличена или снижена относительно 5x10s бактериальных клеток на мл, эффективность трансформации снижается как минимум на 20% [79].
Одним из способов повышения эффективности агробактериальной трансформации является использование фенольных соединений. Фенольные соединения индуцируют экспрессию генов, ответственных за перенос Т-ДНК в клетку растения [38]. Davis с соавторами в экспериментальной работе показал влияние ацетосирингона на эффективность трансформации [66]. Альтернативным вариантом является использование фидерных клеток различных растений (табака,