Разработка промышленной технологии производства рекомбинантного препарата ULP - протеиназы для протеолитического процессинга гибридных белков

• Автор: Литвинова, Наталия Алексеевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 158 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Система посттрансляционной модификации SUMO

1.1.1. Метаболический путь системы SUMO. Белок-модификатор SUMO и его изоформы

1.1.2. SUMO-специфические протеиназы (SENP)

1.1.3. Биологические функции системы SUMO

1.1.4. Участие системы SUMO в регуляции транскрипции

1.1.5. Действие системы SUMO в обеспечении стабильности генома

1.1.6. Белки, взаимодействующие с SUMO нековалентным образом

1.1.7. Регулирование SUMO модификации

1.2. SUMO-протеиназы
1.2.1. Семейство SUMO-протеиназ
1.2.2. Структура SUMO-протеиназ
1.2.3. Субстратная специфичность SUMO-протеиназ
1.2.4. Регуляция SUMO протеиназ
1.3. Клеточная роль SUMO-протеиназ
1.4. Использование SUMO-протеиназы в биотехнологии
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1.1. Используемые штаммы
2.1.2. Реактивы, растворы
2.1.3. Создание штаммов-продуцентов
2.1.4. Создание системы клеточных банков
2.1.5. Культивирование штаммов-продуцентов
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Создание штаммов-продуцентов SUMO-протеиназ
2.2.2. Создание системы клеточных банков промышленного штамма — продуцента, и их характеризация
2.2.3. Разработка схемы промышленного культивирования штамма -продуцента ULP - протеиназы
2.2.4. Разработка схемы выделения и очистки фермента
2.2.5. Исследование стабильности фермента ULP - протеиназы при хранении
2.2.6. Технологическая схема производства фермента «Дрожжевая ULP1-протеиназа»
2.2.7. Спецификация критериев качества на продукт «Дрожжевая ULP1 — протеиназа»
2.2.8. Экономическая эффективность процесса производства фермента ULP1-протеииаза
3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ
РЕЗУЛЬТАТОВ

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

В отличие от деконъюгации SUMO из модифицированных белков, процессинг предшественников SUMO протеиназой SENP часто специфичен [98, 113, 119]. В основе этого лежит дискриминация контактов между протеиназой и остатками пропептида, которые следуют за С-концевым диглицином SUMO [98]. Последовательность пропептида в прекурсорах SUMO паралогов сильно различаются (Рисунок 1), и некоторые пропептиды подходят лучше, чем другие для связывания с карманами, которые расположены рядом с каталитическими остатками протеиназ [98]. В настоящее время исследование процессинга предшественников SUMO ограничены их взаимодействием с протеиназами SENP1 и SENP2.
Из других SENP, SENP5 имеет значительную активность процессинга предшественника SUMO-3 и ограниченную активность по отношению к SUMO-1 [113]. SENP6 и SENP7 не обладают процессинговой активностью в отношении предшественников SUMO [106], а протеиназа SENP3 не на данный момент не исследована, так как очищенная активная форма этого фермент до сих пор не получена (Таблица 2).
Протеиназа DESI1 была идентифицирована при скрининге белков, которые связываются с транскрипционным репрессором BZEL (BTB-ZF белок экспрессируемый в эффекторных лимфоцитах) [87]. Протеиназа DES! I диффузно локализована по всей цитоплазме и ядре в НЕК293Т клетках. Анализы по деконъюгации SUMO, проведенные как в ЕГЕК293Т клетках, так и с помощью рекомбинантных белков, показали, что специализацией DESI1 является удаление SUMO из транскрипционного репрессора BZEL. DESI1 деконъюгирует из BZEL и SUMO-1, и SUMO-2/3 и слабо расщепляет цепи nonH-SUMO-2/3 [87,120].
Важно отметить, что по субстратной специфичности протеиназа DESI1 отлична от протеиназ класса SENP, так как DEST1 не деконъюгирует известные субстраты протеиназ SENP [87]. Транскрипционный репрессор BZEL в настоящее время является единственным известным субстратом DESI1. Делеция DESI1 в клетках НЕК293Т не изменяет профили детектируемых конъюгатов SUMO [87], что свидетельствует о том, что DESI1 имеет ограниченное количество субстратов.