Применение каталитических маркеров на основе двухвалентного кобальта в планшетном иммуноанализе с визуальным учётом результатов

• Автор: Филатов, Павел Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 113 с. : ил.

Оглавление

Список использованных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА В „

ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (Обзор литературы)

1.1. Иммунохимические методы в современной диагностике

1.2. Твердофазние методы иммуноанализа

1.3. Форматы твердофазных методов иммуноанализа

1.3.1 .Анализ на плоских подложках

1.3.1.1. Дот-блот иммуноанализ

1.3.1.2. Многопрофильный дот-анализ

1.3.2. Анализы, выполняемые на пористых подложках
1.3.2.1. Иммунохроматография
1.3.2.2. Иммунофильтрация
1.3.3. Иммуноанализ на микрочастицах
1.3.4. Иммуноанализ в микротитровальных планшетах
1.4. Иммобилизация белков на твёрдой фазе
1.5. Метки (маркеры), используемые в твёрдофазных методах
1.5.1. Радиоизотопные маркеры
1.5.2. Ферментные маркеры
1.5.3. Фотоэмиссионные маркеры
1.5.4.Корпускулярные маркеры
1.5.5. Маркеры на основе неорганических катализаторов
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Методы
Глава 3. РАЗРАБОТКА ПЛАНШЕТНОГО ВАРИАНТА ИММУНОАНАЛИЗА
С ВИЗУАЛЬНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ НА ОСНОВЕ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРОВ КОБАЛЬТСОДЕРЖАЩИХ ЗОЛЕЙ
3.1. Получение и свойства кобальтсодержащих иммунозолей
3.2. Проявление кобальтсодержащих иммунозолей
3.3. Оптимизация условий проведения иммуноанализа
3.4. Оценка эффективности применения кобальтсодержащих иммунозолей
3.5. Оценка стабильности золей при хранении
ВЫВОДЫ
Литература

Список использованных сокращений:
ББ - боратный буферный раствор
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
ВГС - вирус гепатита С
ДФК - дифенилкарбазон
ИКА - иммунокаталитический анализ
ИКР - индикаторная каталиметрическая реакция
ИФА - иммуноферментный анализ
ИКА - иммунокаталитический анализ
К+ - положительный контроль
К- - отрицательный контроль
КБР - концентрат блокирующего раствора
ОП - оптическая плотность
ОПкрит - критическое значение оптической плотности
ОСО - отраслевой стандартный образец
ОФД - ортофенилдиамин
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ПВП - поливинилпирролидон
ИХ - пероксидаза хрена
РБР-К - раствор для разведения конъюгатов (иммунозолей)
РБР-К-Г - разводящий буферный раствор для конъюгата на основе глицина РБР-К-Т - разводящий буферный раствор для конъюгата на основе трис РБР-К-Ф - разводящий буферный раствор для конъюгата на основе фосфатов РБР-С - разводящий буферный раствор для сывороток РБР-С-Г - разводящий буферный раствор для сывороток на основе глицина РБР-С-Т - разводящий буферный раствор для сывороток на основе трис РБР-С-Ф - разводящий буферный раствор для сывороток на основе фосфатов РИА - радиоиммунный анализ
СКк - золь сульфида кобальта, полученный при избытке катионов

СКа - золь сульфида кобальта, полученный при избытке анионов ТМБ - тетраметилбензидин
ТСБ-Т — трис-солевой буферный раствор с твин-20 ФБ — фосфатный буферный раствор
ФКк - золь ферроцианида кобальта, полученный при избытке катионов
ФКа - золь ферроцианида кобальта, полученный при избытке анионов
ФСБ-Т - фосфатно-солевой буферный раствор с твин-
ФСП - фармакопейная статья предприятия
ЩФ - щелочная фосфатаза
ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота
a/IgG-Hum - антитела против иммуноглобулинов класса G человека
IgG - иммуноглобулины класса G
NADP - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
SpA - белок A Staphylococcus aureus

позволяющие выявлять пероксидазу в диапазоне концентраций от 0,4 до 100 нг/мл. В дот-методиках используются субстратные смеси, продуцирующие нерастворимые продукты, на основе 5-аминосалициловой кислоты, хлорнафтола и диаминобензидина, позволяющие обнаруживать фермент в диапазоне 5-800 нг/мл [11]. Большинство хромогенных субстратов (за исключением ТМБ [66]) для выявления пероксидазы обладают мутагенным и канцерогенным действием и требуют осторожного обращения [90, 181]. Все субстраты для выявления пероксидазной метки нестабильны и светочувствительны, поэтому приготовление их производится непосредственно перед проявлением, а само проявление выполняется в темноте [11]. Однако чувствительность ИФА никогда в полной мере не удовлетворяла потребности исследователей, а методика часто требовала длительных периодов для генерирования интенсивности сигналов, достаточной для точной оценки аналитов [58]. Для увеличения чувствительности ИФА были разработаны различные стратегии. Самый простой метод состоит в том, чтобы увеличить количество связанного фермента, используя непрямые методы детектирования типа реакции биотин/авидин [95, 111] или комплексы фермент/антифермент [112]. Другие подходы, используемые для увеличения чувствительности - использование флюорогенных субстратов [161], удаление неспецифического связывания переносом иммунных комплексов [96] или сэндвич-формат иммуноанализа для мелких молекул [49, 159]. Методики амплификации фермента оказались эффективны не только в увеличении чувствительности, но также и в уменьшении времени анализа [56]. Были разработаны несколько систем амплификации фермента, но наиболее часто используемой является методика «cofactor cycling», которая увеличивает чувствительность в 30-50 раз [108, 158]. Несколько лет назад было сообщено о биотин-тирамидной системе амплификации фермента, названной «CARD» (catalyzed reporter deposition), и ее применении в иммунологическом анализе [60, 61], а затем о более чувствительной ее модификации - «SuperCARD» [58], позволяющей снизить