Разработка новых препаратов на основе моноклональных антител для диагностики холерных вибрионов O1, O139 серогрупп ускоренными методами

• Автор: Кретенчук, Оксана Федоровна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Ростов-на-Дону
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЖ - асцитическая жидкость

БСА - бычий сывороточный альбумин

Г АТ - селективная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин

ДАБ - диаминобензидин

ДИА - дот-иммунофементный анализ

ДМСО - диметилсульфоксид

ИФА - иммуноферментный анализ

КББ - карбонат-бикарбонатный буфер

КЖ - культуральная жидкость

ЛПС - липополисахарид
МКА - моноклональные антитела
МФА - метод флуоресцирующих антител
НАФ - неполный адъювант Фрейнда
ОП - оптическая плотность
ПАФ - полный адъювант Фрейнда
ПЭГ - полиэтиленгликоль
РА - реакция агглютинации
РИФ - реакция иммунофлуоресценции
РПИФ - реакция прямой иммунофлуоресценции
РНИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции
РП - реакция преципитации
ТУ - технические условия
ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
| - штаммы со сниженной агглютинабельностью видовой 01 сывороткой

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Гибрид омная технология получения МКА
1.2. Серологические методы исследования в лабораторной
диагностике холеры
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Лабораторные животные
2.2. Бактериальные штаммы
2.3. Клеточные линии позвоночных
2.4. Питательные среды и реактивы
2.5. Гибридизация клеток
2.6. Клонирование гибридом
2.7. Культивирование гибридом т itro и т у/уо
2.8. Криоконсервирование гибридом
2.9. Подъем из жидкого азота гибридом
2.10. Очистка специфических иммуноглобулинов
2.11. Маркировка иммуноглобулинов ФИТЦ
2.12. Метод иммунофлуоресценции
2.13. Иммуноферментные методы
2.14. Иммуноблоттинг
2.15. Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони
2.16. Реакция агглютинации
2.17 Методы статистической обработки результатов
ГЛАВА 3. ГИБРИДОМЫ-ПРОДУЦЕНТЫ МКА К АНТИГЕНАМ
V СНОЬЕЛАЕ 01 И 0
3.1. Подъем из азота и оптимизация условий культивирования
гибридом-продуцентов МКА, направленных к поверхностным эпитопам V ско1егае 0
3.2. Получение и выведение в массовую культуру гибридом,
продуцирующих видоспецифические МКА
3.3. Оценка продукции специфических иммуноглобулинов
гибрид омами в условиях т уЫго
3.4. Получение и накопление в препаративных количествах МКА в
виде АЖ
3.5. Выделение и очистка специфических иммуноглобулинов
различными методами
ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА МКА, НАПРАВЛЕННЫХ К ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКИМ ЭПИТОПАМ V СНОЬЕЛЛЕ 01 И 0
4.1. Определение специфичности и активности МКА из АЖ и КЖ в
различных серологических реакциях
4.2. Определение класса специфических иммуноглобулинов

4.3. Оценка сохранности О-антигенных детерминант холерных вибрионов при различных способах инактивации
4.4. Эпитопная направленность МКА 01 и 0
ГЛАВА 5. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ НА ОСНОВЕ МКА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ 01 И 0139 СЕРОГРУПП
5.1. Оптимизация условий получения видоспецифических флуоресцирующих моноклональных препаратов для идентификации V. сНокгае 01 и 0
5.2. Наработка экспериментальных серий флуоресцирующих препаратов для испытания на широком наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов и подготовка нормативно-технических документов
5.3. Лиофилизация флуоресцирующих МКА
5.4. Оценка серологической активности флуоресцирующих препаратов после лиофилизации и в процессе хранения
ГЛАВА 6. ПРИМЕНЕНИЕ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ МКА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ 01 И 0139 СЕРОГРУПП В РЕАКЦИИ СЛАЙД-АГГЛЮТИНАЦИИ
6.1. Исследование агглютинабельности МКА, выделенных из АЖ и КЖ, в реакции слайд-агглютинации
6.2. Получение экспериментальных серий диагностических агглютинирующих МКА и их испытание на широком наборе штаммов
6.3 Стабильность лиофилизированных диагностических
агглютинирующих МКА при хранении
6.4. Оценка возможности применения диагностических наборов для выявления холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, подвергнутых воздействию различных факторов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

субъединица - 0,3 мкг/мл; Ol- и 0139-антиген - 0,14 - 0,16 мкг/мл), вопрос о ее широком применении остается открытым.
Из вышеизложенного очевидно, что существует потребность в
серологических методах, отличающихся высокой специфичностью,
чувствительностью, эксрессностью, простотой выполнения. Начиная с 2000 г. исследования в этом направлении были продолжены путем привлечения достижений гибридомной технологии. В лаборатории гибридом Ростовского противочумного института были выведены стабильные гибридомы,
продуцирующие МКА к V cholerae 0139 (2002 г.). Оценка их активности в реакциях агглютинации, ИФА, дот-ИФА, РНИФ на всей коллекции штаммов холерного вибриона 0139, имеющейся в институте, показала их строгую специфичность и отсутствие перекрестных реакций с антигенно-близкими
микроорганизмами [9, 10]. Также в РостНИПЧИ (2003 г.) для выявления V.cholerae 0139 были получены экспериментальные образцы люминесцирующих моноклональных иммуноглобулинов, отличающихся строгой специфичностью и отсутствием перекрестных реакций с представителями гетерологичных микроорганизмов. Содержание холерных вибрионов в пробах, подлежащих тестированию, должно быть не ниже 1хЮ5 - 106 м.к./мл. [12]. В диссертации
О.С.Чемисовой (2006 г.) описаны МКА к ЛПС V. cholerae 0139, на основе которых были начаты работы по созданию экспериментальных серий флуоресцирующих препаратов [112].
В институте «Микроб» проводились работы по конструированию иммуноферментных тест-систем с использованием МКА. Так, в диссертации
Н.Е. Терешкиной (2004 г.) описано создание на основе разноэпитопных MICA и поликлональных антител к ЛПС V. cholerae 0139 экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции возбудителя холеры независимо от наличия у него капсулы [102]. H.A. Сырова в своей работе (2005 г.) показала преимущества применения разработанных высокочувствительных ТИФА (0,3 - 0,5 мкг/мл), включая ДИА (0,06 - 0,25 мг/мл), на основе мышиных МКА к типоспецифическим О-антигенам V. cholerae