Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека

• Автор: Казачинская, Елена Ивановна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 338 с. : ил.

Список использованных сокращений

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Иммунодиагностика инфекционных заболеваний

1.2. Технология получения гибридомных клеток - продуцентов моноклональных антител (МКА)

1.3. Применение МКА для изучения и выявления патогенов разной природы

1.4. Характеристика исследуемых вирусов и вызываемых ими заболеваний у людей, методов выявления, коллекций специфических МКА

1.4.1. Филовирусы Марбург и Эбола

1.4.2. Флавивирус Западного'Нила

1.4.3. Вирус герпеса человека 5 типа (цитомегаловирус человека)

Заключение по обзору литературы

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы и реактивы, оборудование
2.2. Биологические препараты (вирусы, рекомбинантные белки, сыворотки
и иммуноглобулины)
2.3. Основные методы
2.3.1. Культивирование миеломных клеток
2.3.2. Иммунизация животных - доноров иммунных спленоцитов
2.3.3. Получение гибридных клеточных линий, продуцирующих МКА
2.3.4. Клонирование гибридом
2.3.5. Криоконсервация гибридом
2.3.6. Наработка и очистка препаративных количеств МКА in vivo
2.3.7. Определение константы аффинности МКА
2.3.8. Приготовление конъюгатов МКА с биотином
2.3.9. Разработка генетических конструкций, экспрессирующих в E.coli полноразмерные гены матриксных белков VP40 филовирусов и нуклеопротеина
вируса Эбола
2.3.10. Получение и очистка рекомбинантных белков VP40 филовирусов и нуклеопротеина вируса Эбола
2.3.11. Электрофорез
2.3.12. Иммуноблоттинг

2.3.13. Твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА)
2.3.14. Двухцентровой ИФА (“сэндвич” - метод)
2.3.15. Культивирование перевиваемых культур клеток Vero, RH, L68,
2.3.16. Получение антигена вируса Западного Нила
2.3.17. Приготовление биологических проб от мышей, зараженных вирусом
Западного Нила
2.3.18. Получение антигена цитомегаловируса человека
2.3.19. Получение антигена вируса простого герпеса 2 типа
2.3.20. Иммуноцитохимический метод
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Глава 3. ПРИМЕНЕНИЕ МКА И РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ЛИХОРАДОК 138-908 МАРБУРГ И ЭБОЛА
3.1. Получение МКА, специфичных к вирусу Марбург
3.1.1. Получение и изучение препаратов вируса Марбург: поиск оптимального
способа инактивации и оценка антигенных свойств
3.1.2. Получение гибридом, продуцирующих МКА к вирусу Марбург
3.1.3. Свойства МКА, специфичных к вирусу Марбург
3.2. Получение МКА, специфичных к вирусу Эбола
3.2.1. Тестирование препарата вируса Эбола
3.2.2. Получение гибридом, продуцирующих МКА к вирусу Эбола
3.2.3. Свойства МКА к вирусу Эбола
3.3. Выявление иммунодоминантных белков вирусов Марбург и Эбола
3.4. Разработка генетических конструкций, экспрессирующих полноразмерные гены
матриксных белков VP40 филовирусов и нуклеопротеина вируса Эбола
3.5. Получение рекомбинантных матриксных белков VP40 филовирусов и нуклеопротеина вируса Эбола в экспрессионной системе E.coli
3.6. Сравнительное изучение антигенных и иммуногенных свойств природных и рекомбинантных белков VP35, VP40, VP24, NP и GP вируса Марбург с помощью поликлональных антител
3.7. Изучение возможности использования инактивированного вируса Марбург и рекомбинантных белков для выявления специфических IgG в сыворотках крови иммунизированных животных и человека, переболевшего геморрагической лихорадкой Марбург

3.8. Изучение антигенных и иммуногенных свойств рекомбинантных белков вируса Марбург с помощью панели МКА
3.9. Отбор парных МКА, неконкурирующих за антигенные эпитопы вирусных и рекомбинантных белков вируса Марбург
3.10. Выявление вирусных и рекомбинантных белков вируса Марбург в двухцентровом ИФА на основе двух видов МКА
3.11. Сравнительное изучение антигенных и иммуногенных свойств природных и рекомбинантных белков VP35, VP40 и NP вируса Эбола с помощью
поликлональных антител
3.12. Изучение антигенных и иммуногенных свойств рекомбинантных белков вируса Эбола с помощью панели МКА
3.13. Отбор парных МКА, неконкурирующих за антигенные эпитопы
вирусных и рекомбинантных белков вируса Эбола
3.14. Выявление вирусных и рекомбинантных белков вируса Эбола в двухцентровом
ИФА на основе двух видов МКА
Глава 4. ПРИМЕНЕНИЕ МКА ДЛЯ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ЗАПАДНОГО 209
НИЛА
4.1. Получение и характеризация МКА, специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (LEIV—VL99-27889-human)
4.2. Изучение антигенных свойств препаратов вируса Западного Нила с применением МКА
4.3. Выбор пар МКА для эффективного выявления антигена вируса Западного Нила
4.4. Иммунохимическое выявление вируса Западного Нила в биопробах
Глава 5. ПРИМЕНЕНИЕ МКА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОСТРОЙ 224
ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ЧЕЛОВЕКА
5.1. Получение коллекции мышиных гибридом, продуцирующих МКА к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типа (ВГЧ - 5) (ЦМВ)
5.2. Характеризация МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65 ВГЧ-5
5.3. Выявление вирусного белка рр65 в клетках, инфицированных ВГЧ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложения

погибших трипаносом (Waihanji Е.М. et al., 1993). Описано также применение МКА с целью оценки эффективность лекарственных препаратов для лечения от трипаносом лабораторно инфицированных собак (Egbe-Nwiyi T.N. et al., 1995).
Проведено сравнение методов Ag-capture ELISA на основе МКА и ДНК гибридизации для выявления инвазии кошек легочным сосальщиком Paragonimus heterotremus. Оба метода давали 100 %-ную специфичность и чувствительность 73,7 % и 100 %, соответственно. Ag-capture ELISA позволял выявлять 0,24 нг/мл антигенов с молекулярной массой 22 кДа и 31,5 кДа (Maleewong W. et al., 1997). С помощью МКА охарактеризован белковый состав печеночного сосальщика Opisthorchis felineus, определены основные иммуногены и сконструированы лабораторные тест-системы на основе биотинилированных МКА к белку р 105 для выявления антигенов в желчи и кале (Котелкин АТ., 2000). Описаны также тест-сисгемы с применением МКА для выявления в клинических образцах Lamblia intestinalis (Stibbs H.H., 1989; Vinayak V.K., 1993) и Schistosoma haematobium (Salah F. et al., 2000).
В отношении грибковых заболеваний, известно применение МКА для диагностики кандидоза в форматах Ag-capture ELISA и метода латексагглютинации (Fujita S. et al., 1992). Использование пары МКА к белку 41 кДа Candida albicans позволяло определять 32 нг/мл специфического белка в неочищенном экстракте. Авторы предполагают, что использование этого метода может быть полезным для выявления грибков в клинических образцах (Rodrigues J.A. et al., 2007).
В аллергологии МКА используются для повышения чувствительности и расширения спектра выявляемых аллергенов. Пыльца растений вызывает сенную лихорадку. Так в диагностике сенной лихорадки МКА к аллергенам Par jl и Par j2 пыльцы постенницы (Panetaria) позволяют определять 25-8000 пг/мл аллергенов (Arilla М.C. et al., 2006) При диагностике астмы МКА субкласса IgM позволяют выявлять основной аллерген растения Altemaria alternate - гликопротеин 29 кДа (Abebe М. et al., 2006). Получены МКА класса А к овальбумину (Tanikawa Т. et al., 2007). Из экстракта киви методами молекулярной биологии получен рекомбинантный белок, который использован для иммунизации мышей. Ag-capture ELISA на основе МКА, специфичных к рекомбинатному белку, позволял выявлять 0,2-9,0 нг/мл аллергена в экстрактах киви и продуктах, содержащих киви (Gavrovic-Jankulovie М. et al., 2008). Разработаны также МКА к аллергенам домашнего пылевого клеща (Chua K.Y. et al., 2008).
Применяются МКА и в медицинских исследованиях. Например, получены МКА
позволяющие чувствительностью до 2 нг/мл проводить определение полной ДНК или ее
фрагментов в биологических жидкостях (Du Clos Т.W. et al., 1986). На основе пары МКА
разработан быстрый метод Ag-capture ELISA для количественного (в диапазоне 2-1000