Разработка методов направленного 11β- и 14α-гидроксилирования стероидов

• Автор: Ядерец, Вера Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Классы стероидов, влияние структуры

стероидной молекулы на активность

2.2. Применение кортикостероидов и их синтетических

аналогов в медицине и ветеринарии

2.3. Применение модифицированных стероидов

для регуляции репродуктивной функции

2.4. Физиологические основы микробиологических трансформаций

стероидов
2.5. Гидроксилирование стероидных соединений
2.6. Реакция 11 (3-гидроксилирования в схеме синтеза
глюкокортикоидных препаратов
2.7. Реакция 14а-гидроксилирования
2.8. Зависимость направления гидроксилирования стероидов от
структуры молекулы
2.9. Влияние условий роста на трансформационную
способность
2.10. Повышение доступности стероидов для микроорганизмов -
трансформаторов
2.11. Синтез прегнанов на основе 17-кетоандростанов
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Реактивы
3.2. Микроорганизмы и методы их культивирования
3.2.1. Штаммы, использованные в работе
3.2.2. Условия хранения и выращивания грибов
3.3. Получение клонов Curvularia lunata, устойчивых к солям
тяжелых металлов
3.4. Получение клонов Curvularia lunata, устойчивых к
генетицину «G-418»
3.5. Трансформация стероидов грибами
3.5.1. Трансформация стероидов отмытым мицелием
3.5.2. Трансформация стероидов растущими клетками гриба
3.6. Анализ продуктов трансформации
3.6.1. Тонкослойная хроматография
3.6.2. ВЭЖХ
3.7. Выделение продуктов трансформации
3.7.1. Препаративная хроматография
3.7.1.1. Хроматографирование на пластинках
3.7.1.2. Хроматографирование на колонке
3.8. Протонный магнитный резонанс (ПМР)
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Выбор способа 14а-гидроксилирования
4.2. Исследование гидроксилазной активности плесневых грибов

4.3. Исследование субстратной специфичности штамма
С. lunata ВКПМ F-
4.4. Гидроксилирование АД и CN-АД с помощью
С. lunata ВКПМ F-
4.5. Поиск путей регуляции 11р/14а-гидроксилирования
с помощью мицелия С. lunata ВКПМ F-
4.5.1. Определение возраста наиболее активного мицелия
С. lunata ВКПМ F-981 и его оптимальное количество
4.5.2. 1113- и 14а-Гидроксилирование в присутствии источника
углерода
4.5.2.1. 11 р- и 14а-Гидроксилированис в цитратном буфере
4.5.2.2. 11 [5- и 14а-Гидроксилирование в присутствии глюкозы
или сахарозы
4.5.3. Влияние растворителей на процессы lip-и
14а-гидроксилирования
4.5.4. Использование МЦД в процессах lip- и 14а-гидроксилирования
4.5. Гидроксилирование кортексолона и андростендиона при высоких
нагрузках
4.6. Трансформация кортексолона мицелием С. lunata, резистентным
к солям тяжелых металлов
4.7. Разработка способа 11Р-гидроксилирования
4.7.1. Трансформация кортексолона клоном гриба С. lunata,
резистентным к генетицину «G-418»
4.7.2. 11 p-Гидроксилирование 1 ба-метил-кортексолопа с
помощью С. lunata F-
4.8. Синтез пролигестона и его аналога
4.8.1. Получение пролигестона
4.8.2. Синтез 21-ацетата 14а,17а-пропилидендиоксипрегн-4-ен-21-ол-3,20-диона
(21-ацетат 14а,17а-пропилидендиокси в-ва «S»)
4.9. Исследование контрацептивной активности пролигестона и
ацетата 21-гидрокси-пролигестона
5. ВЫВОДЫ
6. Список цитируемой литературы
1. ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность работы.
Стероидные лекарственные препараты занимают важное место среди синтетических лекарственных средств. Благодаря своей уникальной биологической активности, не ограничивающейся гормональным действием, они используются при лечении свыше 100 распространенных заболеваний, проявляя противовоспалительную, антиаллергическую, противошоковую, канцеролитическую, диуретическую и многие другие виды активности, а также для решения таких важных задач, как безопасное планирование семьи у людей и регуляция рождаемости у животных.
Являясь поливалентными соединениями, стероиды оказывают влияние на широкий круг процессов жизнедеятельности, что и объясняет наличие побочных эффектов при лечении стероидными препаратами. Устранить нежелательные побочные эффекты, а также усилить биологическую активность или изменить ее направленность можно с помощью структурной модификации природных соединений.
Опыт синтеза новых стероидных соединений, являющихся структурными аналогами природных гормонов, и изучения их активности, открывает перспективу дальнейших исследований с целью создания новых эффективных препаратов для медицины. Поэтому поиск веществ, обладающих высокой и пролонгированной активностью, не отягощенной сопутствующими побочными эффектами, является актуальной задачей.
Среди различных методов трансформации стероидной молекулы, проблема селективного гидроксилирования относится к числу важнейших в химии стероидов, поскольку введение гидроксильной группы в определенные положения молекулы определяет величину и направленность терапевтического действия. Гидроксистероиды используются при лечении широкого спектра заболеваний и применяются при лечении как в различных областях медицины (акушерство, гинекология, кардиология, неврология,

(=Mucorparasiticus) ATCC 6476), Thamnostylum (Helicostylum piriforme ATCC 8992), Acremonium, Curvularia, Myrothecium, Phycomyces способны вводить гидроксильную группу в 14а-положение прогестерона и других стероидов с умеренным выходом [68, 111, 118, 156].
В очень незначительном количестве 14а-гидроксипроизводные стероидов образуют и некоторые бактерии [36, 133].
Также для получения 14а,17а-дигидроксипрегнанов используют микробиологическое гидроксил ирование в-ва «S» грибной культурой
С. lunata с последующим удалением 21-гидроксильной группы [139].
Как следует из литературы, 14а-гидроксилирование прегнанов протекает с невысоким выходом гидроксистероидов. Так, например, при гидроксилировании прогестерона грибными культурами Н. piriforme и М. griseocyanus выход 14а-гидроксипрогестерона составил 32% и 13,4% соответственно [84].
Также известны методы получения 14а-ОН-А4ПР культурой Mortierella isabellina ATCC 42613, иммобилизованной в кальций-альгинатный гель. Необходимо отметить, что реакция гидроксилирования протекала только в 5-10%-ных растворах МеОН [78].
Введение гидроксильной группы в 14а-положение 17-кетостероидов может быть осуществлено как химическим, так и микробиологическим путем. Однако, известные из литературных источников химические методы введения 14-гидроксигруппы (окисление соответствующих соединений двуокисью селена или хромовым ангидридом) отличаются жесткими условиями и чрезвычайно низкими выходами, поэтому микробиологические методы предпочтительнее, а иногда и единственно возможны [84, 118, 139, 158].
Способность к введению гидроксильной группы в 14а-положения АДД, АД и 9а-ОН-АД была показана при гидроксилировании культурой Gongronella butleri VKM F-1033, при этом выход полученных 14а-гидроксисоединений составил 16.6%, 18.3% и 52% соответственно [95]. Для