Биодеградация углеводородов нефти плазмидосодержащими микроорганизмами-деструкторами

• Автор: Ветрова, Анна Андрияновна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 169 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Влияние загрязнения нефти на окружающую среду

Глава 2. Общий углеводородный состав нефти

Г лава 3. Деградация углеводородов нефти

3.1 .Микробная деградация парафинов и циклопарафинов

3.2. Биодеградация ароматических углеводородов

3.2.1. Биодеградация моноциклических ароматических углеводородов

3.2.2. Биодеградация полициклических ароматических углеводородов
3.3. Микробное окисление асфальтенов
Глава 4. Плазмиды биодеградации
4.1. Плазмиды биодеградации парафинов и циклопарафинов
4.2. Плазмиды биодеградации ароматических углеводородов
4.2.1. Плазмиды биодеградации моноциклических ароматических углеводородов
4.2.2. Плазмиды биодеградации полициклических ароматических углеводородов 36 Глава 5. Распространение катаболических плазмид в природе
Глава 6. Роль катаболических плазмид в деградации углеводородов нефти
Глава 7. Методы очистки нефтезагрязненных территорий
Глава 8. Коммерческие препараты на основе углеводородокисляющих
микроорганизмов для очистки почвенных и водных экосистем от нефти и нефтепродуктов
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Питательные среды, источники углерода и энергии, антибиотики
2.3. Условия культивирования
2.4. Определение эмульгирующей активности
2.5. Измерение индекса эмульгирования
2.6. Определение поверхностного натяжения
2.7. Определение эффективности очистки нефтезагрязненных систем '
2.7.1. Гравиметрический метод анализа
2.7.2. Определение общего содержания углеводородов нефти и. нефтепродуктов 54 (дизельное топливо) методом инфракрасной (ИК) спектроскопии

2.7.3. Определение фракционного состава остаточной нефти в пробах относительно 55 исходного состава
2.8. Конъюгационный перенос бактериальных плазмид
2.9. Элиминация бактериальных плазмид
2.10. Выделение плазмидной ДНК микроорганизмов
2.11. Полимеразная цепная реакция
2.12. Определение влагоемкости почвы
2.13. Определение pH почвы
2.14. Приготовление модельных почвенных систем
2.15. Внесение инокулята в почву в лабораторных модельных системах
2.16. Отбор проб
2.17. Мониторинг штаммов-деструкторов в процессе деградации нефти в 59 модельных почвенных системах
2.18. Условия проведения полевого эксперимента
2.19. Отбор проб в полевом эксперименте
2.20.Определение численности микроорганизмов методом стандартных серийных
разведений
2.21 .Статистическая обработка результатов
П1. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Био деградация углеводородов нефти плазмидосодержащими
микроорганизмами по сравнению с бесплазмидными вариантами
3.1.1. Характеристика штаммов и биодеградация нефти бесплазмидными
бактериями и плазмидо содержащими микроорганизмами-деструкторами
полициклических ароматических углеводородов в жидкой минеральной среде
3.1.2. Биодеструкция нефти охарактеризованными бесплазмидными бактериями и 70 плазмидосодержащими микроорганизмами-деструкторами моноциклических ароматических углеводородов в жидкой минеральной среде
3.1.3. Характеристика природных штаммов, содержащих плазмиды био деградации 78 нафталина, толуола, камфары и их элиминаптов, и биодеградация нефти исследуемыми микроорганизмами в жидкой минеральной срсдс
3.1.4. Биодеградация нефти и динамика численности бесплазмидных штаммов и 82 плазмидосодержащих вариантов в модельных почвенных системах
3.2. Биодеструкция нефти наиболее активными штаммами-деструкторами и
составление эффективной ассоциации плазмидо содержащих бактерий для биодеградации нефти и нефтепродуктов

3.2.1. Физиологическая характеристика штаммов-нсфтедеструкторов
3.2.2. Составление ассоциации для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов
3.3. Оценка эффективности биодеградации нефти и нефтепродуктов ассоциацией плазмидосодержащих штаммов «ВиО» при культивировании консорциума, в жидкой минеральной среде
3.3.1. Оценка убыли нефти при культивировании ассоциации «ВиО» при температурах 2-4°С и 24°С в жидкой минеральной среде с 15% нефти и при 50 °С в жидкой минеральной среде с 2% нефти в течение 30 дней
3.3.2. Изучение динамики численности микроорганизмов ассоциации «ВиО» при температурах 2-4°С и 24°С в жидкой минеральной среде с 15% нефти и при 50 °С в жидкой минеральной среде с 2% нефти в течение 30 дней
3.4. Сравнительная эффективность деструкции нефтепродуктов ассоциацией «ВиО» и биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл»
3.4.1. Сравнительная эффективность деструкции нефти и- дизельного топлива ассоциацией «ВиО» и биопрепаратами «МикроБак» ич «Биоойл» в жидкой минеральной среде
3:4.2. Сравнительная эффективность деструкций нефти ассоциацией «ВиО» и биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл» в модельных почвенных системах
3.5. Полевые испытания ассоциации «ВиО» и,коммерческих биопрепаратов ЗАО-«Биоойл» ' ' •
3.6. Депонирование штаммов, изучение их патогенности, подготовка патентной заявки
3.6.1. Депонирование штаммов
3.6.2. Изучение патогенности микроорганизмов
3.6.3. Патентование ассоциации для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами
IV. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 .Биодеградация углеводородов нефти плазмидосодержащими микроорганизмами по сравнению с бесплазмидными вариантами
4.2. Биодеструкция нефти наиболее активными штаммами-нефтедеструкторами и составление эффективной ассоциации1 плазмидосодержащих бактерий для биодеградации нефти и нефтепродуктов
4.3. Оценка эффекгавности биодеградации нефти и нефтепродуктов ассоциацией плазмидосодержащих штаммов «ВиО» в лабораторных условиях
4.4. Сравнительная эффективность деструкции нефтепродуктов ассоциацией «ВиО» -

соединений, были выявлены в катаболической плазмиде, рР51, с размером 110 кб с помощью гибридизации (Dabrock et. al., 1994).
Из статьи Кима известно, что природный штамм Rhodococcus sp. DK17, способный расти на о-ксилоле, бензоле, толуоле, феноле, этилбензоле, изопропилбензоле и других алкилбензольных изомеров, содержит 2 линейные плазмиды pDkl (380 т.п.н) и pDk2 (330 т.п.н.). Причем плазмида pDk2 содержит гены деградации алкилбензолов (Kim D.et.al., 2002).
Хоменковым К.Г. с соавторами проведено ПЦР-клонирование генов катехол-1,2- и
2.3-диксигеназ ключевых ферментов орто-и мета-пугей утилизации ароматических углеводородов из микробных консорциумов, утилизирующих в условиях лабораторных мини-реакторов следующие летучие органические соединения: толуол, стирол, этилбензол, о-ксилол, м-ксилол и нафталин (Хоменков с соавт., 2005). Показано наличие генов обоих путей в консорциуме, утилизирующем м-ксилол, только генов орто-пуги в консорциумах, утилизирующих о-ксилол, стирол и этилбензол, и только мета-пути в консорциумах, утилизирующих нафталин и толуол. Клонированные гены орто-пути (С120) из консорциумов, утилизирующих стирол и этилбензол, были сходны с аналогичными генами, локализованными на плазмиде pND6 из Pseudomonas putida, гены орто-пути из консорциумов, утилизирующих о-кенлол и м-ксилол, с генами хромосомной локализации из P. putida. Гены мета-пути (С230) из консорциумов, утилизирующих толуол и нафталин, были близки к аналогичным генам, ранее описанным на плазмидах pWWO и pTOL.
Хальером — Сулье с соавт. был выделен штамм тХ из бензинозагрязненного грунта. Штамм был идентифицирован как Pseudomonas putida, обладающий большой плазмидой (рМХ), содержащей хyl гены, кодирующие бензолмонооксигеназу и катехол-
2.3-диоксигеназу, участвующих в путях деградации толуола или м-ксилола. Этот новая TOL-подобная плазмида была стабильна на протяжении двух сотен генераций. После копъюгационного переноса в микроорганизм P. putida F1, который обладает tod-хромосомным путем биодеградации толуола, трансконъюгант P. putida Fl(pMX) был способен расти на бензоле, толуоле, м-ксилоле, п - ксилоле и этилбензола в качестве единственных источников углерода. Катехол-2,3-диоксигеназа в трансконъюганте обладала более широкой субстратной специфичностью, по сравнению с донорной и реципиентной клетками (Hallier-Soulier et.al., 1999).
Детальный биохимический и генетический анализ показал, что несущие pWWO-плазмиду бактерии могут расщеплять 4-этил-бензоат только до 4-этилкатехола, который инактивирует один из основных ферментов данного метаболического пути, катехол-2