Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов

• Автор: Ведерников, Виталий Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 224 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение вируса гепатита С

1.2. Жизненный цикл ВГС

1.3. Вариабельность генома ВГС и его генотипы

1.4. Алгоритмы диагностики и лечения вирусного гепатита С

1.5. Полимеразная цепная реакция с регистрацией продуктов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ)

1.6. ПЦР в режиме реального времени и схемы флуоресцентной детекции

1.7. Методы анализа графиков накопления ДНК

1.7Л. Алгоритмы сглаживания
1.7.2. Вычитание фоновой составляющей
1.7.3. Определение значения Cq
1.7.4. Пороговый метод сравнения графиков накопления ДНК (Ct)
1.7.5. Метод максимума второй производной - нахождение Cq по форме кривой
1.7.6. Методы оценки эффективности амплификации
1.7.7. Метод серийных разведений
1.7.8. Определение Е по приросту флуоресценции в экспоненциальной фазе
1.7.9. Аппроксимация сигмоидой или логистической функцией
1.7.10. Оценка эффективности амплификации в экспоненциальной фазе с использованием сложных моделей
1.7.11. Обсуждение методов определения Cq и Е
1.8. Общий дизайн количественного ПЦР-исследования с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени
1.9. Общие рабочие характеристики тестов для выявления и количественного определения РНК ВГС
1.10. Генотипирование ВГС
1.11. Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Исследуемый материал
2.1.2. Реактивы
2.1.3. Диагностические наборы реагентов
2.1.4. Расходные материалы
2.1.5. Оборудование
2.1.6. Олигонуклеотиды
2.1.7. Контрольные образцы
2.1.8. Панель буферов
2.2. Методы
2.2.1. Установление нуклеотидной последовательности
2.2.2. Выделение РНК
2.2.3. Проведение ОТ-ПЦР
2.2.4. Лиофильное высушивание готовых реакционных смесей (ГРС)
2.2.5. Использование интеркалирующих красителей для контроля образования
продуктов ПЦР и определения параметров плавления различных дуплексов
2.2.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.7. Наработка ВКО
2.2.8. Обработка флуоресцентных данных в программе «РеалБест-диагностпка»
2.2.9. Статистическая обработка данных
2.2.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка набора на основе ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления и количественного определения РНК ВГС
3.1.1. Подбор специфических праймеров и зондов для обнаружения РНК ВГС
методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени
3.1.2. Оптимизация состава реакционной смеси для ОТ-ПЦР и параметров
циклирования
3.1.3. Разработка и применение экзогенного внутреннего контрольного образца (ВКО)
3.1.4. Оптимизация алгоритма обработки флуоресцентных кривых, определение
значения Сд
3.1.4.1. Фильтр устранения выбросов/разрывов
3.1.4.2. Сравнительный анализ разработанного алгоритма обработки графиков
накопления флуоресценции с другими программами
3.1.5. Разработка алгоритма количественного определения РНК ВГС
3.1.6. Устойчивость к ингибиторам
3.1.7. Валидационная постановка
3.1.8. Валидация набора «РеалБест РНК ВГС»
3.1.8.1. Аналитическая чувствительность (предел детекции)
3.1.8.2. Линейный диапазон измерений
3.1.8.3. Сходимость (прецизионность)
3.1.8.4. Специфичность анализа
3.1.8.5. Генотип ВГС и количественные оценки
3.1.8.6. Точность количественных оценок и сравнение с тестами других производителей
3.2. Разработка набора реагентов для генотипирования ВГС - «РеалБест РНК ВГС-1/2/3»
3.2.1. Разработка подхода для создания генотип-специфичных зондов

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АЛТ - аланинаминотрансфераза Анти-ВГС - антитела к вирусу гепатита С ВГВ - вирус гепатита В ВГС - вирус гепатита С ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ВКО — внутренний контрольный образец ГРС - готовая реакционная смесь ГС - гепатит С
ИФА - иммуноферментный анализ
КО - калибровочный образец
ME - международные единицы
ОКО - отрицательный контрольный образц
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной тран
ПИН - потребитель инъекционных наркотиков
ПКО — положительный контрольный образец
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном вре>
РНК - рибонуклеиновая кислота
СОП - стандартный образец предприятия
ХГС - хронический гепатит С
ЭДТА - этилендиаминотетраацетат
ВААРТ - высокоактивная антиретровирусная терапия
5’UTR - 5’ некодирующая область
FDA - управление по контролю качества пищевых прод>
средств США
NAT - nucleic acid technologies (технологии амплификащ нуклеиновых кислот)
LNA - locked nucleic acid (модифицированный аналог ну MGB - minor groove binder (малобороздочный лиганд) , UFA - universal fluorescence amplification (схема детекцш флуоресцентно-меченных праймеров)
3.2.2. Конструирование системы генотипирования ВГС
3.2.2.1. Подбор зондов для выявления генотипа 1 ВГС
3.2.2.2. Изучение свойств зонда G1Z
3.2.2.3. Подбор зондов для выявления генотипа 2 ВГС
3.2.2.4. Подбор зондов для выявления генотипа 3 ВГС
3.2.3. Оптимизация системы генотипирования
3.2.3.1. Совместное использование зондов для генотипирования
3.2.3.2. Влияние зондов на эффективность ОТ-ПЦР
3.2.3.3. Подбор концентрации зондов
3.2.3.4. Определение аналитической чувствительности
3.2.4. Комплектация наборов «РеалБест РНК ВГС», «РеалБест РНК ВГС-1/2/3», «РеалБест РНК ВГС-генотип» и разработка инструкций
3.2.5. Апробация наборов реагентов «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» и «РеалБест РНК ВГС-генотип»
3.2.5.1. Генотипирование геновариантов, циркулирующих на территории Западной
Сибири, с использованием набора «РеалБест РНК ВГС-1/2/3»
3.2.5.2. Исследования маркеров ВГС у ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС в
рамках апробации «РеалБест РНК ВГС» и «РеалБест РНК ВГС-1/2/3»
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение I. Регистрационные удостоверения
Приложение II. Инструкции к наборам

Использование неспецифичных методов позволяют выявлять любую дцДНК, образующуюся в ходе реакции, включая димеры праймеров и пр. (рис. 11Ж).
Специфичные методы позволяют преимущественно регистрировать накопление фрагмента ДНК определенной последовательности. Специфичные методы детекции продуктов ПЦР отличаются наличием в реакционной смеси меченого олигонуклеотида (рис. 11А,Б,Г,Д) (или нескольких олигонуклеотидов (рис. 11В,Е)), комплементарного уникальной части амплифицируемой последовательности.
Использование неспецифических систем детекции (рис. 11Ж) затруднительно в клинической практике, особенно при определении низкой вирусной нагрузки, так как помимо ДНК-мишени выявляют неспецифические продукты амплификации. Из специфических методов детекции TaqMan® (Roche Molecular Diagnostics) и Molecular Beacons (Abbott Laboratories) наиболее часто используются в диагностических тестах.
Как уже упоминалось, флуоресцентные схемы детекции предполагают пропорциональное увеличение репортерного сигнала и концентрации продукта амплификации на каждом цикле. Однако, современные детектирующие амплификаторы позволяют детектировать увеличение флуоресцентного сигнала, связанное с амплификацией, при достижении количества продуктов ПЦР до 1010 - 10й копий (Nc?). Цикл, на котором анализирующая программа может отличить сигнал от фоновой флуоресценции, называют Cq (quantification cycle) или цикл для количественных оценок (в соответствии с руководством M1QE [196]; наиболее часто встречающиеся в литературе обозначения С/ (threshold cycle) или Ср (crossing point) заменены обозначением Cq, так как во всех случаях имеется ввиду характеристическая точка, описывающая флуоресцентную кривую). Значение Cq при условии экспоненциальной амплификации напрямую связано с исходной концентрацией ДНК-мишени.