Биосинтез янтарной кислоты дрожжами из этанола

• Автор: Юсупова, Алсу Ильдаровна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробиологический синтез органических кислот

1.2. Янтарная кислота, её характеристика и применение

1.3. Продуценты янтарной кислоты и условия их культивирования

1.3.1. Дрожжи-продуценты янтарной кислоты

1.3.2. Грибы-продуценты янтарной кислоты

1.3.3. Бактерии-продуценты янтарной кислоты

1.4. Механизмы биосинтеза янтарной кислоты
1.5. ■ Этанол, как субстрат для получения янтарной кислоты
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования
2.2. Культивирование дрожжей
2.2.1. Состав и подготовка основной среды
2.2.2. Подготовка посевного материала
2.2.3. Методы культивирования дрожжей
2.3. Метод получения янтарной кислоты из культуральной жидкости дрожжей
У 11ро1уНса ^
2.3.1. Сепарирование биомассы и получение пермеата культуральной жидкости
2.3.2. Обработка пермеата перекисью водорода
2.3.3. Выделение целевого продукта
2.4. Аналитические методы
2.4.1. Методы контроля роста дрожжей
2.4.2. Определение концентрации этанола и аммонийного азота
2.4.3. Определение концентрации органических кислот
2.4.4. Определение концентрации изолимонной, а-кеюглутаровой и янтарной
кислот энзиматическим методом
2.4.5. Определение содержания липидов
2.5. Определение активности ферментов
2.6. Методы определения выживаемости клеток У. Иро1уйса
2.7. Биохимическая характеристика препарата янтарной кислоты

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Биосинтез янтарной кислоты у дрожжей С. сШепиШа и С. 2еу1апо'и1ен
3.1.1. Скрининг дрожжей и отбор штаммов-продуцентов янтарной кислоты на среде
с этанолом
3.1.2. Оптимизация условий культивирования и состава питательной среды для
дрожжей С. саГепиЫа и С. геу1атш1ея
3.1.2.1. Влияние концентрации сульфата аммония на рост дрожжей С. сШепиШа
3.1.2.2. Влияние концентрации этанола на рост дрожжей С. сШепиЫа и С. 2еу1атМех
3.1.2.3. Влияние концентрации цинка на рост дрожжей С. сШепиШа и С. 2еу1атяс1ех и
накопление янтарной кислоты
3.1.2.4. Влияние аэрации на рост дрожжей С. сШепиЫа и накопление янтарной
кислоты
3.1.3. Динамика роста С. сМепиЫа и С. zeylanoid.es и экскреция метаболитов
3.1.4. Динамика накопления запасных веществ у дрожжей С. сШепиШа и С.
2еу1апогс1ех
3.1.5. Участие глиоксилатного цикла в биосинтезе янтарной кислоты из этанола
3.2. Метод получения янтарной кислоты с использованием дрожжей У Нро1уйса
3.2.1. Отбор продуцента и условия биосинтеза а-кетоглутаровой кислоты дрожжами
3.2.2. Реакция декарбоксилирования а-кетоглутаровой кислоты до янтарной
кислоты в культуральной жидкости
3.2.3. Влияние перекиси водорода на выживаемость V Иро1уИса 212 и количество
образуемой янтарной кислоты из а-кетоглутаровой кисло ты
3.2.4. Культивирование дрожжей У. Иро1уНса 212 в присутствии перекиси водорода
3.2.5. Культивирование дрожжей У Нро1уНса 212 в ферментере с целью наработки
янтарной кислоты
3.3. Выделение ЯК из культуральной жидкости дрожжей У. Нро1уИса 212
3.4. Биохимическая характеристика препарата янтарной кислоты
Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение 1
Приложение 2
Приложение 3
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АДГ — алкогольдегидрогеназа
АК - аконитат-гидратаза
АлДГ - альдегидцегидрогеназа
АО - алкогольоксидаза
АТФ - аденозинтрифосфат
ГЛЦ — глиоксилатный цикл
ИДГ - изоцитратдегидрогеназа
ИЛК - трео-Оа(+)-изолимонная кислота
КГК — а-кетоглутаровая кислота
ЛК - лимонная кислота
МДГ - малатдегидрогеназа
НАД(Н) - никотинамидадениндинуклеотид (восстановленный)
НАДФ(Н) - никотинамидадениндинуклеотидфосфат (восстановленный)
11ВК — пировиноградная кислота
СДГ - сукцинатдегидрогеназа
УК - уксусная кислота
ЦС - цитратсинтаза
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
Ф - фумараза
ФЕП - фосфоенолпируват
ФК - фумаровая кислота
ЯК — янтарная кислота

пара атомов водорода переносится от яблочной кислоты к кислороду через дыхательную цепь, результатом чего является окислительное фосфорилирование АДФ. Таким образом, глиоксилатный шунт поставляет для различных процессов биосинтеза как энергию, так и четырехуглеродистые промежуточные продукты.
Активность ферментов ГЛЦ во многом определяется источником углерода в среде. ГЛЦ цикл не работает при выращивании на субстратах, катаболизм которых приводит к образованию ПВК. Он включается при выращивании микроорганизмов на Сг-соединениях (УК, этанол) или на субстратах, из которых образуются С2 соединения (липиды или л-алканы).
В работе Ермаковой И.Т. (Ермакова И. Т., 1971а) показано, что при
культивировании дрожжей С. lipolylica в среде с гексадеканом и ацетатом активность фермента изоцитрат-лиазы была в 6-15 раз выше, по сравнению с ростом дрожжей на глюкозе. В литературе также имеются данные, что активность изоцитрат-лиазы была высокой у продуцентов ЛК - дрожжей Y. lipolytica, при росте на уксусной кислоте и этаноле (Ermakova et.al, 1986; Finogenova et al., 2002).
Таким образом, в результате одного оборота цитрагно-глиоксилатного цикла из одной молекулы шестиуглеродной ИЛК и одной молекулы ацетил-СоА образуется две молекулы четырёхуглеродной кислоты (сукцинат и малат), и, в конечном счёте две молекулы оксалоацетата.
Механизм экскреции ЯК из клетки у дрожжей до сих пор не изучен, а сведения о механизме выхода других органических кислот противоречивы. В частности, имеется указание на наличие активного выброса маната у дрожжей S. cerevisiae (Salmon, 1987), в то время как показано, что АТФаза плазмалеммы не учувствуст в экскреции цитрата из клеток Yarrowia lipolytica (Кулаковская и др., 1994). В работе Петрова (Петров, 2006) было, показано, что в плазматической мембране дрожжей S. cerevisiae имеются переносчики сукцината, которые осуществляют выброс данного метаболита из клеток дрожжей в культуральную среду, а сам процесс происходит с использованием энергии Д|Хн+ (электрохимический градиент протонов).
2.5. Этанол, как субстрат для получения янтарной кислоты
Гетеротрофные микроорганизмы способны использовать в качестве источника углерода и энергии самые различные органические углеродсодержащие соединения. Углеродный скелет молекул органических соединений обычно является объектом метаболических превращений в направленном синтезе аминокислот, органических кислот и многих других продуктов микробного синтеза.