Анионная пероксидаза табака : получение рекомбинантного фермента и его применение как компонента биоаналитических систем

• Автор: Захарова, Галина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ТОР - анионная нероксидаза табака;

пТОР - нативная анионная пероксидаза табака;

гТОР - рекомбинантная анионная пероксидаза табака;

HRP - пероксидаза хрена;

HRP С - изоформа С пероксидазы хрена;

МпР - марганец-пероксидаза;

LiP - лигнин-пероксидаза;

СсР - цитохром с пероксидаза;

SPP - пероксидаза батата;

BSA - бычий сывороточный альбумин;

PEG - полиэтиленгликоль;
DEAE-сефароза - диэтиламиноэтанол сефароза;
ABTS - 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) аммония;
DTT - дитиотреитол;
GSSG - окисленный глутатион;
1PTG - изопропил-р-О-тиогалактопиранозид;
SDS — додецилсульфат натрия;
RZ -Reinheitszahl, отношение поглощений на 403 нм и 280 нм
(А403/А280);
TEMED - N, N, N', У-тетрамети лэтилендиамин ;
ТМВ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин;
CLIA - хемилюминесцентный иммуноанализ;
IgG - иммуноглобулины класса G;
IgA - иммуноглобулины класса А;
IgM - иммуноглобулины класса М;
HRP-IgG - конъюгат нативной пероксидазы хрена с иммуноглобулинами
класса G;
rTOP-IgG - конъюгат рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа с
иммуноглобулинами класса G;
rTOP-F140Y-IgG -конъюгат мутантной формы рекомбинантной пероксидазы табака rTOP-F140Y с иммуноглобулинами класса G;
SATA - М-сукцинимидил-Б-ацетилтиоацетат;
SMCC - сукцинимидил-4-(К-малсимидомстил)миклогексан
карбоксилат;
sulfo-SMCC - сульфосукцинимидил-4-(]Ч-малеимидометил)циклогексан
карбоксилат;
NHS - N-гидроксисукцинимид;
sulfo-NHS -N-гидроксисульфосукцинимид натрия;
EDAC - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид;
GAM-IgG - поликлональные иммуноглобулины класса G козы к
иммуноглобулинам мыши;
ДМФА - АА-диметилформамид;
EDTA - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты;
EGTA - этиленгликоль тетрауксусная кислота;
PBS - натрий-фосфатный буфер;
2-IT - 2-иминотиолан;
СВЭ - стандартный водородный электрод.
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Структура и свойства пероксидазы табака
2.1.1. Классификация пероксидаз. Общие сведения о пероксидазе табака

2.1.2. Механизм катализа ферментов из суперсемейства «растительных» пероксидаз
2.1.3. Инактивация гем-содержащих пероксидаз пероксидом водорода
2.1.4. Хемилюминесцентная реакция оксиления люминола
2.2. Влияние ионов кальция на свойства пероксидаз
2.3. Экспрессия и рефолдинг рекомбинантной пероксидазы табака
2.3.1. Методы in vitro ренатурации рекомбинантных белков, экспрессирующихся в виде телец включения
2.3.2. Рефолдинг белков методом разведения
2.3.3. Рефолдинг белков с использованием диализа
2.3.4. Хроматографические методы рефолдинга белков
2.3.5. Рефолдинг при высоком гидростатическом давлении
2.4. Использование пероксидазы табака в качестве ферментной метки для иммуноанализа
2.4.1. Ферментные метки в иммуноанализе
2.4.2. Методы конъюгации ферментов с антителами
2.4.3. Использование SMCC и sulfo-SMCC для модификации белков
2.4.4. Использование SATA для модификации белков
2.5. Применение пероксидазы табака для создания биосенсоров
Уровень экспрессии гТОР в полученном штамме E. coli BL21-CodonPlus(DE3)pLysS составлял около 40 % от общего белка клетки. Однако гТОР экспрессируется в клетках E. coli в виде нерастворимых телец включения, поэтому для получения активного фермента необходимо проведение процедуры in vitro ренатурации (рефолдинга).
На сегодняшний день существует множество подходов к проведению рефолдинга рекомбинантных белков, основные из которых будут рассмотрены более подробно в следующих разделах.
2.3.1. Методы in vitro ренатурации рекомбинантных белков,
экспрессирующихся в виде телец включения
Экспрессия рекомбинантных белков в клетках E. coli широко применяется на практике. Около 40 % белков для биофармацевтических целей получают с использованием данной системы экспрессии [83]. Это обусловлено в первую очередь простотой её использования, легкостью масштабирования, низкой себестоимостью и быстрым ростом биомассы [84,85]. Однако из-за отсутствия в клетках E. coli систем посттрансляционных модификаций белков в них зачастую происходит агрегация неправильно свернутых молекул целевого белка (образование т.н. телец включения). В этом случае для получения биологически активного белка необходимо проводить процедуру in vitro ренатурации (рефолдинга). Так как оптимальные условия рефолдинга для всех белков значительно различаются, эта стадия является главным «узким местом» при получении рекомбинантных белков. С другой стороны, белки в тельцах включения в основном не подвержены протеолитической деградации, а также могут быть легко выделены из клеточного лизата за счёт чередования промывок и центрифугирования, при этом доля целевого белка в отмытых тельцах включения может достигать 90 %, что значительно упрощает его последующую очистку [86,87].
В последние два десятилетия было предложено множество различных подходов к in vitro ренатурации рекомбинантных белков [88-97]. Также стали