Получение и характеристика рекомбинантных антигенов Mycobacterium Tuberculosis как компонентов потенциальных вакцинных препаратов

• Автор: Аксенова, Екатерина Ивановна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Список сокращений
Ар - ampicillin, ампициллин
Ьр, п.о.; kb - base pairs, пара оснований; kilo base pairs = 1,000 bp CBD, ЦСД - cellulose-binding domain, целлюлозосвязывающий домен CFP-10 — Culture filtrate protein
dNTP - deoxynucleotide triphosphate, дезоксинуклеотидтрифосфаты ELTSA -твердофазный иммуноферментный анализ ELISPOT -твердофазный иммуноферментный анализ точки ESAT-6 - Early secreted antigenic target 6 kDa protein FBP - fibronectin binding protein, связывающие фибронектин белки GM-CSF - granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор Km - kanamycin, канамицин МНС - major histocompatibility complex Nal - nalidixic acid, налидиксовая кислота ORF - open reading frame
PBS - phosphate buffered saline, фосфатно-солевой буфер
PMSF - phenylmethylsulfonyl fluoride, фенилметлсульфонилфторид
PPD - Purified Protein Derivative, очищенный туберкулин
RD - regions of diference
Sm - streptomycin, стрептомицин
ST-CF - short-term culture filtrate, фильтрат ранней культуры
TAMRA - тетраметилкарбоксиродамин
TNF - tumor necrosis factor, фактор некроза опухоли
AT-TAMRA - антитела, меченые TAMRA
а.о. - аминокислотные остатки
амк — аминокислота
БСА, BSА — бычий сывороточный альбумин, bovine serum albumin вода Milli-Q — дважды деионизированная вода д. вода - дистиллированная вода
ДМСО, DMSO - диметилсульфоксид, dimethyl sulfoxide ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНКаза I - дезоксирибонуклеаза I
ДСН, SDS - додецилсульфат натрия, sodium dodecyl sulfate ДСН-ПАА1 -электрофорез, ПААГ-SDS - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (денатурирующие условия)
ИПТГ - изопропил-р-0-1-тиогалактопиранозид ИФН- гамма, ИФН-у - интерферон-гамма КОЕ - колонии образующие единицы ПААГ - полиакриламидный гель
ПСА, APS - персульфат аммония, ammonium persulfate
ПЦР, PCR -полимеразная цепная реакция, polymerase chain reaction
РНКаза А - рибонуклеаза А
среда LB - среда Luria-Bertani
ТБ - туберкулез
ТЕ — ту беркулиновые единицы
физ. раствор - физиологический раствор
ЭДТА, EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭТС, FSC - эмбриональная телячья сыворотка, fetal calf serum
ЭФ - электрофорез

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Туберкулез (ТБ), как заболевание, поражающее людей, известно еще с древних времен. В настоящее временя ТБ считается одной из самых опасных инфекционных болезней, распространенных повсеместно, и остается важной причиной гибели людей во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) ежегодно регистрируется около 9,0 млн. новых случаев, смертность от ТБ в среднем составляет 1,5-2 млн. человек в год; на 2010 г. в мире зарегистрировано более 3 млрд. инфицированных. Около 80% этих цифр составляет вклад Африки (южнее Сахары), Юго-Восточной Азии и Полинезии, однако ситуация в других частях Земного шара остается сложной [1, 3]. Россия относится к странам с высоким уровнем заболеваемости ТБ. Рост показателя заболеваемости в России начался с 1991 г. — 34,0 на 100 тыс. населения, в 2000 г. - 90,7 на 100 тыс., в 2010 г. - 56,35 на 100 тыс. [27, 18].
Единственной разрешенной в настоящее время вакциной от ТБ является вакцина BCG (Bacillus Calmette-Guerin), которая представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Она безопасна, недорога, достаточно эффективно защищает детей от диссеминированного (милиарного) ТБ, однако не защищает взрослых от легочного ТБ, а именно эта форма болезни приводит к распространению инфекции и тяжелой эпидемической ситуации. Кроме того, использование BCG вызывает различные поствакцинальные осложнения [137]. Поэтому очевидна высокая актуальность совершенствования BCG и разработка новых иммунопрофилактических средств против ТБ.
Один из предлагаемых подходов повышения эффективности вакцинации — схема так называемой «prime-boost» (от англ. поддержка главного) вакцинации, когда для первичной иммунизации («prime») используется вакцина BCG, а для последующих ревакцинаций («boost») - разрабатываемые препараты нового поколения [41]. Субъединичные генно-инженерные препараты, содержащие протективные антигены микобактерий, представляют большой интерес. Они обладают такими существенными преимуществами как низкая реактогенность, высокая чистота получаемого продукта, а также безопасность для людей с нарушенным иммунитетом. Однако при иммунизации отдельными антигенами для индукции достаточного иммунного ответа необходимы сильные адъюванты,

натрия, бромфеноловый синий, бромистый этидий, додецилсульфат натрия (ДСН, SDS), П^Д^ДФ-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), персульфат аммония (ПСА, APS), ф ени л мети л суд ь фонил фторид (PMSF), диметилсульфоксид (ДМСО, DMSO),
, изопропил-Д-В-1-галактопиранозид (ИПТГ), агароза для ДНК электрофореза,
(Serva, Германия); Agarose DNase/RNase Free (Panreac, Испания); этанол, изопропанол, изобутилкарбинол, хлороформ, фенол, ацетат аммония, глицерин,
акриламид (АА), 1Ч,К'-метилен-бисакриламид (МБА), бутанол, 2-мсркаптоэтанол,
Тритон Х-100, краска Кумасси R-250, азид Na (NaN3), Tween 20, Tween 80, казеинат натрия (маркировки реактивов х.ч. и о.с.ч. Химмед, Россия). Антибиотики: ампициллин (Ар, 75 мг/мл), канамицин (Кш, 25 мкг/мл), стрептомицин (Sm, 100 мг/мл), пенициллин 100 ед./мл (Sigma, США). Культуральная работа: бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар, среда Дюбо (Difco, США); физиологический раствор стерильный (физ. раствор), раствор Версена стерильный, среда RPMI 1640 стерильная (ПанЭко, Россия);
> эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС, FSC) (РАА Laboratories, Австрия), бычий
сывороточный альбумин (БСА, BSA) (Sigma, США). Очистка белков: сферическая пористая целлюлоза с гетерогенной структурой (частично аморфномикрокристаллическая, macroporous bear cellulose preswollen gel) - Perloza MT500 100-250 pm, MT200 100-250 pm, MT50 100-250 pm (Iontosorb, Czech Republic);

сферическая непористая целлюлоза с гетерогенной структурой Celluflow С-25 и ТА-25 (Chisso America, США); аморфная модифицированная целлюлоза по Гурвичу А. Е. [9] с нашими модифициями; сефадекс G-25, мочевина (Sigma, США); дезоксирибонуклеаза 1 сухая (ДНКаза I) 1500 ед./мг (Самсон-Мед, РФ). Иммунологические исследования: связывающие моноклональные антитела к ИФН-у мыши клон R4-6A2, биотинилированные антитела к ИФН-у мыши клон XMG 1.2 (BD PharMinger, США); конъюгат щелочной фосфатазы со стрегпавидином, субстрат щелочной фосфатазы BC1P/NBT (Sigma, США); аффинно очищенные антитела козы на иммуноглобулины IgG, IgA, IgM человека, G АН Iss (1 мг/мл) (ИМТЕК, РФ); [метил-3Н] тимидин («СПб «ИЗОТОП», РФ); флуоресцентная метка TAMRA (Синтол, РФ); 1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимид гидрохлорид, (EDC), сульфо-И-гидроксисукцинимид (S-NHS) (Merck, Германия); набор для иммобилизации антигенов Bio-Plex Amine Coupling Kit (Bio-Rad, США).