Регуляция транскрипции цитокинин-связывающим белком 70Кд кукурузы

• Автор: Бровко, Федор Александрович
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 196 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список используемых сокращений Г 5 |

і Введение

Глава 1 | Обзор литературы

1. 1 Гормоны растений и методы исследования передачи гормонального сигнала. (

і 1.1. | Цитокинины. Активность, биосинтез и метаболизм I

! і ; Молекулярные механизмы рецепции и передачи цитокининового сигнала в : растении. 23 1 і

і і.з. і Передача гормонального сигнала в клетках животных. 24 [

і і.з.і. «Ядерные рецепторы». 24 :

1.3.2. Мембранные рецепторы эстрогенов 29 I [

1.3.3. Рецепторы стероидных гормонов митохиндриальной локализации. 32 {
1.4. Клеточная сигнализация у прокариот. 33 |
1.5. Молекулярные механизмы рецепции цитокининов в растении. 38 |
1.5.1. Мембранные рецепторы цитокининов. Основные положения
1.5.2. Белки бикомпонентной регуляторной системы, задействованные в передаче цитокининового сигнала. 48 і
І 1.5.2.1. Белки - переносчики фосфатной группы в гистидиновой протеинкиназной сигнальной системе — фосфогрансмиттерные белки (АНР)
І 1.5.2.2. Белки регуляторы ответа. 51 І
1.5.2.3. Характеристика регуляторов ответа А-типа. 52 і
1.5.2.4. Характеристика регуляторов ответа В-типа
1.5.2.5. Цитокинин-индуцируемые транскрипционные факторы арабидопсис
1.5.2.6. Особенности функционирования двукомпонентной рецепторной сигнальной системы
; 1.6.1. 1 Внутриклеточные рецепторы цитокининов. 67 :
| 1.6.2. і Цитокинин-зависимый регулятор транскрипции хлоропластов. 69 І

Г лава 2 1 Материалы и методы исследования. "72 :
Г лава 3 { Результаты и их обсуждение
3.1. : Выделение и характеристика ЦСБ70. 89 ;
3.1.1. Метод 1. Выделения ЦСБ70 из этиолированных проростков кукурузы с отделением вторичных метаболитов хроматографией на основе гидрофобных взаимодействий, на Тоуореаг1 Н¥60. 94 :
3.1.2. Метод 2. Разделение белков и "фенолов" растительного экстракта фракционированием СА в присутствии небольших концентраций полиэтиленгликоля (ПЭГ). 97 I
3.1.3. Первая схема выделения ЦСБ 101 |
3.1.4. Применение аффинной хроматографии на иммобилизованном лиганде для : выделения ЦСБ70. 102 |
1.3.5. Вторая группа методов выделения ЦСБ70 105 I
3.1.6. Третья схема выделения ЦСБ
| 3.2. Определение цитокинин-связывающей активности белка
I 3.3. Функциональная характеристика ЦСБ. Особенности взаимодействия с гормонами растений
[ 3.4. Регуляция ЦСБ70 транскрипции. Анализ реакции и ее зависимость от ЦСБ70 и зеатина. 111 |
3.5. Иммунохимические исследования ЦСБ70
3.5.1. Получение моноклональных антител к ЦСБ70
| 3.5.2. 1 Эпитопный анализ ЦСБ70
3.5.3. Влияние гормона на взаимодействие ЦСБ70 с антителами
3.5.4. Разработка тест-системы для анализа ЦСБ70 на основе сандвич-варианта ИФА в сочетании с стрептавидин-биотиновой системой
3.5.5. Регуляция ЦСБ70 транскрипции. Анализ влияния антител к ЦСБ70 на активацию элонгации транскрипции белком. 123 ;
3.5.6. Иммунохимический анализ ЦСБ70 подобных белков в злаках
3.5.7. Исследование локализации ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения корня. 126 |
3.5.8. Локализация ЦСБ70 в этиолированном проростке кукурузы 128 ! |

1 35.9 | Изучение содержания ЦСБ70 в различных органах проростка в процессе его | | роста. 132 ! ;
3.5.10. | Анализ содержания цитокининов в кончике корня проростка кукурузы :
3.5.11 ; Анализ содержания ЦСБ70 в тканях растения кукурузы иммуноблотингом. 135 :
3.6. | Иммуноцитохимические исследования ЦСБ70 136 |
3.6.1. Подбор условий для иммунохимического исследования ЦСБ70. Анализ применимости антител для изучения локализации ЦСБ70 в клетках растения кукурузы. 137 ;
; 3.6.2. Анализ специфичности и способности антител узнавать ЦСБ70 на срезах
| 3.7. Изучение внутриклеточной локализации ЦСБ70 в этиолированных проростках кукурузы иммуноцитохимическими методами. 144 |
3.7.1. Анализ локализации ЦСБ70 в клетках с помощью антител первой группы. 144 | |
3.7.2. Исследование локализации ЦСБ70 в клетках меристемы кончика корня и листа методами электронной микроскопии с помощью антител к ЦСБ70 первой группы и коньюгата стрептавидин-золото
3.8. Изучение локализации ЦСБ70 в пластидах проростков кукурузы иммуноцитохимическими методами с использованием МА второй группы
3.8.1. Изучение локализации ЦСБ70 в амилопластах. 151 |
3.8.2. Анализ локализации ЦСБ70 в этиопластах и хлоропластах с помощью антител второй группы. Исследование методами световой микроскопии 152 !
; 3.8.3. Исследование локализации ЦСБ70 в этиопластах и хлоропластах с помощью антител второй группы методами электронной микроскопии
3.8.4. Изучение локализации ЦСБ70 в хлоропластах зеленых листьев кукурузы
3.9. ЦСБ70 как регулятор элонгации транскрипции в пластидах
| 3.9.1. [Г‘~ 1 ! | Активация с помощью ЦСБ70 этиопластов элонгации транскрипции в лизатах хлоропластов и этиопластов 158 |
Заключение
| 5 Выводы: 168 :
6 Благодарности
7 | Список цитированной литературы

соответствующего субстрата фосфатная группа переносится на остаток аспартата. В качестве акцептора фосфата выступают остатки аспарагиновой кислоты регулятора ответа. Все три стадии требуют ионов двухвалентных металлов. [Stock et. al. 2000]. Бактериальные гистидиновые протеинкиназы и регуляторы ответа включают набор семейств генов, имеющих высокую степень гомологии как по аминокислотной последовательности, так и по пространственной организации молекул. Похожесть этих сигнальных белков позволяет предположить наличие перекрестного узнавания между различными частями двукомпонентной системы. И хотя, с одной стороны, перекрестная сигнализация может помочь эффективнее реагировать на сигналы, во многих случаях желательна или даже необходима строго индивидуальная передача внешнего сигнала и перевод его в комплекс соответствующих биохимических реакций в клетке; при этом она должна исключать перекрестное взаимодействие. Учитывая важность для жизнедеятельности клеток правильности реализации внешних сигналов, возможность перекрестной передачи сигнала и связанные с этим процессы интенсивно исследуются [Warner et. al. 1992].
Одним из хорошо изученных явлений перекрестной сигнализации с участием гистидиновой протеинкиназной системы является ответ Е coli при анаэробном культивировании на нитрите и нитрате как акцепторе электрона. Регулирование генов, необходимых для данного процесса, контролируется рецепторными гистидиновыми протеинкиназами Nar-X и Nar-Q и регуляторами ответа Nar-L и Nar-P [Steward et. al. 2003]. Nar-X предпочтительно отвечает на нитрат и фосфорилирует Nar-L, a Nar-Q, с другой стороны, отвечает на нитрит и нитрат и форсфорилирует оба регулятора ответа Nar-L, и Nar-Q [Stewart and Bledsoe 2003]. И хотя Nar-X необходима клетке для того, чтобы различать сигналы от нитрита и нитрата, регуляторы ответа Nar-L и Nar-P имеют одинаковые участки связывания на ДНК, но имеют различную аффинность связывания с ними. Для Nar-L имеется еще один участок ДНК, с которым он взаимодействует, но с которым не взаимодействует Nar-Р [Darwin et. al. 1997]. Такой тип перекрестной передачи сигнала с участием двух