Участие НАДФН-оксидазы плазмалеммы в генерации супероксид-анион радикала в апопласте

• Автор: Пиотровский, Михаил Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

Цель и задачи исследования

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Активные формы кислорода: образование, структура, свойства

1.2. Редокс-регуляция и передача АФК-сигнала

1.2.1 Обратимое окисление цистеиновых остатков белков

как мишень редокс-регуляции

1.2.2. Факторы транскрипции и АФК

1.2.3 МАПК-каскад и передача АФК-сигнала

1.2.4. Р7г<-мутант АгаЬіііорзіз и специфичность АФК-сигнала

1.3- АФК и экспрессия генов
1.4. Локализация АФК-генерирующих систем
1.4.1 Хлоропласта
1.4.2 Митохондрии
1.4.3 Пероксисомы
1.4.4. Апопласт
1.5. НАДФН-оксидаза растений
1.5.1 ГТОХ-белки: структура и работа каталитического сайта
1.5.2 Гены ЛЬоН Ж)Х-семейства
1.5.3. Регуляция активности НАДФН-оксидазы растений
1.6. Физиологическое значение НАДФН-оксидазы растений
1.6.1. Рост и развитие растений
1.6.2. Абиотический стресс
1.6.3. Замыкающие клетки устьица и АБК-сигналинг
1.6.4. Патогенез и симбиоз
Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1. Выращивание растений
2.2. Получение плазмалеммы
2.3. Определение активности маркерных ферментов
2.4. Определение содержания белка
2.5. Оценка супероксид-продуцирующей активности плазмалеммы
2.6. Оценка пероксидазной активности в растворе по измерению интенсивности флуоресценции родамина
2.7. Определение зон образования АФК в корнях
этиолированных проростков кукурузы
2.8. Кинетика образования перекиси водорода в апопласте
при снижении температуры культивирования суспензии клеток с применением дигидрородамина
2.9. Флуоресцентная микроскопия клеток
2.10. Денатурирующий электрофорез мембранных белков в ПААГ
2.11. Нативный электрофорез высокого разрешения
2.12. Окрашивание гелей
2.13. Определение активности супероксид-продуцирующих ферментов в полиакриламидном геле после ренатурации
белков с нитросиним тетразолием
2.14. Определение пероксидазной активности в ПААГ
2.15. Вестерн-блот анализ
2.16 Определение содержания перекиси водорода в тканях проростков
Глава 3 Результаты и обсуждение
3.1. Изменение содержания Н202 в тканях проростков
после снижения температуры выращивания
3.2. НАДФН-оксидазная активность в апопласте проростков кукурузы
3.3. Продукция АФК клетками суспензионной
культуры ЛгабгТ/сртй МаИапа
3.4. Супероксид-продуцирующая активность плазмалеммы

3.5. Идентификация НАДФН-оксидазы среди белков плазмалеммы с супероксид-продуцирущей активностью
3.6. Значение белок-белковых взаимодействий для активности НАДФН-оксидазы плазмалеммы
Заключение
Выводы
Список литературы

serratus. В работе Foreman с соавт. (2003) на растениях Arabidopsis было установлено, что существует связь между ростом, повышением уровня АФК в апопласте, открыванием кальциевых каналов и увеличением концентрации цитозольного Са2+, причем повышение концентрации АФК и Са2+ происходило непосредственно в апикальной области корневого волоска. Фенотип мутанта AtrbohC/rhd2 (root hair defective 2) характеризовался короткими корневыми волосками в отличие от растений дикого типа. У растений дикого типа, как и в других растений, рост корневых волосков сопровождался увеличением цитозольной концентрации Са2+. У контрольных растений наблюдалось повышение уровня АФК в области апекса в результате активации RBOH, но у мутантных растений эти эффекты отсутствовали. Два других гена AtrbohH и J обладали специфичной экспрессией в тычинках и пыльце, но роль кодируемых ими белков в полярном росте пыльцевой трубки пока еще четко не установлена (Sagi and Flurh,
2006). Однако на растениях табака было показано, что ортолог этих двух специфичных генов NtNox необходим для роста пыльцевой трубки (Potocky et al
2007). Действие специфического ингибитора 11АДФН-оксидазы дифенилен иодониума (ДФИ) оказывало ингибирующий эффект на рост пыльцевой трубки у Picea meyeri (Liu et al., 2009), на прорастание пыльцевого зерна табака (Смирнова и др., 2009) и на рост ризоида клетки водоросли Fucus (Coelho et al., 2008). Эти данные позволили сделать предположение о том, что именно белки RBOF1 являются источником АФК-сигнала.
Роль АФК в ростовых процессах может заключаться не только в участии в сигнальных системах. Они могут быть вовлечены в процессы, направленные на ослабление связей между полимерами клеточных стенок. Была установлена RBOH-зависимая продукция АФК в процессах, связанных с модификацией клеточной стенки при прорастании семян, созревании плодов, росте корня и гипокотиля. При использовании ингибитора ДФИ и гистохимических методов на растениях кресс-салата (Lepidium sativum) и Arabidopsis были получены данные, на основании которых можно сделать предположение о возможной роли RBOH в генерации CV