Значение латеральной гетерогенности PIP-аквапоринов для транспорта воды через плазмалемму растительных клеток

• Автор: Белугин, Борис Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Цель и задачи исследования
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Латеральная гетерогенность мембран
1.1.1. Белковые комплексы мембран
1.1.2. Концепция липидных доменов
1.1.3. Липидные домены - рафты
1.1.4. Белки липидных рафтов
1.1.5. Липидные рафты и детергент-устойчивые мембраны
1.1.6. Липидные рафты в плазмалемме клеток растений
1.2. Фазовое состояние мембран и стерины
1.2.1. Стерины и их роль в растениях
1.2.2. Фазовое состояние мембран
1.2.3. Влияние стеринов на фазовое состояние бислоя
1.3. Липид-белковые взаимодействия в мембране
1.3.1. Типы липид-белковых взаимодействий
1.3.2. Влияние стеринов на белки-транспортеры
1.4. Трансмембранный транспорт воды
1.4.1. Транспорт воды через липидную фазу мембран
1.4.2. Аквапорин-опосредованный путь транспорта воды
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Выращивание этиолированных проростков гороха
2.2. Выделение плазмалеммы
2.3. Определение активности маркерных ферментов
2.4. Выделение фракции детергент-устойчивых мембран из
плазмалеммы флотацией в градиенте плотности ОрбРгер
2.5. Разделение плазмалеммы на фракции разной плотности
2.6. Определение содержания белка
2.7. Денатурирующий электрофорез мембранных белков в полиакриламидном геле

2.8. Вестерн блот анализ Р1Р-аквапоринов
2.9. Оценка фазового состояния липидного бислоя
2.10. Определение содержания стеринов
2.11 .Извлечение стеринов из плазмалеммы
2.12. Экстракция липидов из плазмалеммы для хроматографии
2.13. Двумерная тонкослойная хроматография липидов плазмалеммы
2.14. Оценка осмотической водной проницаемости мембран
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Содержание Р1Р-аквапоринов в детергент-устойчивых и детергент-солюбилизируемых мембранах
3.2. Характеристика фракций плазмалеммы разной плотности
3.3. Фазовое состояние липидного бислоя и осмотическая водная проницаемость фракций плазмалеммы разной плотности
3.4. Влияние стеринов на скорость транспорта воды через плазмалемму растительных клеток
Заключение
Выводы
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ
Согласно современным представлениям транспорт воды через биологические мембраны осуществляется по двум путям: через липидный бислой и с участием аквапоринов — белков, формирующих водные каналы в мембранах. Однако до настоящего времени нет определенного ответа на вопрос о том, каков вклад того или иного пути транспорта воды через мембрану в ее осмотическую водную проницаемость и какими факторами он контролируется (Carvajal et al., 1998; Verkman and Mitra, 2000; Hill et al., 2004). Эти исследования- должны базироваться на фундаментальном свойстве мембран - неравномерном распределении компонентов в латеральной плоскости, т.е. доменной организации. Доменами- называют области мембран, отличающиеся по составу от остальной части мембраны вследствие ограничений в диффузионном обмене их компонентов (Геннис, 1997). Сравнительно недавно в плазматических мембранах эукариот обнаружены специфические домены, смысл существования которых интенсивно изучается. Особенностью таких доменов, получивших название «рафты», является уникальный липидный состав, представленный гликосфинголипидами, фосфолипидами с преимущественно насыщенными жирными кислотами- и стеринами, количество которых значительно выше, чем в других доменах (Simons andikonen; 1997; Pike, 2003). Эти типы липидов обладают высоким сродством друг к другу, и бислой- в зоне рафтов находится в плотном высокоупорядоченном состоянии (London and Brown, 2000). Кроме липидов рафты включают белковые комплексы, для которых, по данным протеомики, характерна высокая степень обогащения компонентами, необходимыми для передачи и восприятия внешних сигналов; защиты от стрессов и патогенов, везикулярного транспорта, а также белками канального типа и транспортерами (Brown and London, 2000; Foster et al., 2003; Borner et al., 2005). Неординарность свойств рафтов вызывает большой интерес к выяснению их роли в функционировании биологических мембран, однако вопрос по-прежнему остается неясным, несмотря на значительный объем

1.4. ТРАНСРАНСМЕМБРАННЫЙ ТРАНСПОРТ ВОДЫ
Вода является основным компонентом большинства клеток и средой, в которой осуществляются биохимические процессы, и происходит диффузия растворенных веществ. С током воды вещества транспортируются по растению. Благодаря теплоемкости и теплопроводности воды организмам легко поддерживать тепловое равновесие; вода прозрачна для лучей видимой части спектра; и, наконец, она мало сжимаема при давлениях, существующих в организмах, благодаря чему растения поддерживают свою структуру (Нобел, 1973). Водный обмен растений имеет существенное значение при выработке адаптаций к абиотическим стрессам и/или селекции соответствующих генотипов с необходимыми агротехническими характеристиками.
Собственно сам процесс поглощения воды растениями и его поток по тканям и клеткам организма вовлечен в большое количество физиологических процессов, таких как растяжение клеток, транспирация и движение устьиц, фотосинтез, загрузка, ксилемы и флоэмы, и т.д. Дефицит воды во внешней-среде, а именно -засуха и засоление почв вызывают у растений перестройки метаболизма; снижение скорости роста, дисфункцию корней, карликовость, и как следствие, гибель организмов (Bernstein, 1975; Mimns, 2002).
Основная функция- биологических мембран в водном обмене клеток -обеспечивать механизмы сопряженного транспорта воды и ионов, питательных веществ, метаболитов, пептидов и белков между клеткой и ее окружением. Через мембраны вода транспортируется по двум путям: 1) диффузией через липидный бислой, 2) облегченной диффузией через белки водных каналов - аквапорины. Каждый из этих путей не существует обособленно друг от друга. В клетках потоки воды через липидный бислой и через аквапорины идут одновременно, а движущей силой для них является градиент водного потенциала. Для каждого из этих путей существуют свои факторы регуляции.