Молекулярное моделирование механизма активации протеинкиназы A Ia

• Автор: Рогачева, Ольга Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 184 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

11 Протеинкиназа А. Общие сведения

1.2. Доменная структура Ria субъединицы

1.3. цАМФ-связывающие домены

1.3.1. Строение цАМФ-связывающих доменов

1.3.2 Модели конформационного перехода цАМФ-связывающих доменов

1.3.3. Лиганды цАМФ-связывающих доменов

1.4. Диссоциация Rla.C комплекса при цАМФ-индуцированной активации ПКА 1а

1.5. Заселенность конформаций отдельных цАМФ-связывающих доменов и R-субъединицы
1.6. Константы, характеризующие активацию ПКА Ia
1.6.1. Значения констант, характеризующих активацию ПКА Ia
1.6.2. Обсуждение приведенных значений констант, характеризующих активацию ПКА Ia
1.6.2.1. Константы диссоциации RC комплекса на свободные R- и С-субъединицы
1.6.2.2. Константы диссоциации цАМФ из цАМФ-связывающих сайтов R-субъединицы
1.6.2.3. Константы активации RC комплекса
1.7. Связь настоящего исследования с литературными данными
2. МЕТОДЫ
2.1. Докинг лигандов в цАМФ-связывающие сайты А- и В-домена Ria
2.2. Квантово-химический анализ параметров водородных связей, образуемых экваториальным атомом кислорода (серы) лиганда и амндиой группой белка
2.3. Изучение конформационных переходов ß-субдомена А-домена Ria, равновесия между его конформациями и влияния на это равновесие мутационных замен R
2.3.1. Подготовка ß-субдомена
2.3.2. Моделирование конформационного равновесия ß-субдомена
2.3.3. Математическая обработка результатов методом кластерного анализа
2.4. Изучение Н—>В конформационного перехода А-домена ПКА Ia
2.4Л. Подготовка А-домена
2.4.2. Моделирование Н->В конформационного перехода А-домена ПКА Ia методами молекулярной динамики

2.4.2.1 Методика моделирования Н—>В конформационного перехода А-домена Ria
2.4.2.2. Метод ускоренной молекулярной динамики (уМД)
2.4.3. Математическая обработка результатов методами факторного и кросскорреляционного анализов
2.5. Дополнительные программы и методики, применяемые при постановке моделирований и анализе их результатов
2.5.1. Выравнивание пространственных структур цАМФ-связывающих доменов и расчет RMSD между ними
2.5.2. Измерение углов между спиралями
2.5.3. Визуализация третичных структур
3. АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИГАНДОВ СО СВЯЗЫВАЮЩИМИ САЙТАМИ А- И В-ДОМЕНОВ ПКА Ia
3.1 Докинг цАМФ в цАМФ-связывающие сайты А- и В-доменов ПКА
3.2. Докинг Бр-цАМФБ в цАМФ-связывающий сайт В-домена ПКА
3.3. Докинг Rp-цАМФБ в цАМФ-связывающий сайт В-домена ПКА Ia
3.4. Квантово-химический анализ параметров водородных связей, образуемых
экваториальным атомом кислорода (серы) лиганда и амидной группой белка
3.5 Обсуждение результатов
3.5.1. цАМФ-связывающий сайт А-домена R-субъединицы, находящейся в составе RC комплекса, может связывать цАМФ
3.5.2. Rp-цАМФБ и Бр-цАМФБ могут образовывать стабильные комплексы как со свободной R-субъединицей, так и с R-субъединицей, входящей в состав RC комплекса
3.5.3. Смещение амидной группы А202(А326) может запускать конформационный переход
цАМФ-связывающих доменов
3.5.4 Численная оценка значений констант, характеризующих процесс активации ПКА la
3.6. Промежуточные выводы
4. МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИГАНДОВ с цАМФ-СВЯЗЫВАЮЩИМ САЙТОМ цЛМФ-СВЯЗЫВАЮЩИХ ДОМЕНОВ ПКА Ia
4.1. Взаимодействие цАМФ с цАМФ-связывающим сайтом А-домена ПКА Ia
4.2. Взаимодействие Rp-uAMPS с цАМР-связывающим сайтом В-домена ПКА Ia
4.3. Обсуждение результатов
4.3.1. Переход А-домена ПКА Ia в В-конформацию запускается смещением амидной группы А202
4.3.2. Экспериментальные подтверждения предложенной модели обратного агонизма Rp-цАМФБ

4.4. Промежуточные выводы
5. АМИНОКИСЛОТНЫЙ ОСТАТОК В ПОЛОЖЕНИИ 209 КАК ФАКТОР СТАБИЛИЗАЦИИ B-KOI [ФОРМАЦИИ А-ДОМЕНА ПКА 1а
5.1. Описание конформаций, принимаемых ß-субдоменом А-домена ПКА 1а
5.2. Заселенность конформаций ß-субдомена А-домена ПКА 1а
5.2.1. ß-субдомен белка дикого типа в комплексе с цАМФ и не связанный с лигандом
5.2.2 ß-субдомен с точечной заменой R209I в комплексе с цАМФ
5.2.3. ß-субдомен с точечной заменой R209E, не связанный с лигандом
5.2.4. ß-субдомен с точечной заменой R209G, не связанный с лигандом
5.2.5. ß-субдомен с точечной заменой R209K, не связанный с лигандом
5.2.6. ß-субдомен с точечной заменой R209K в комплексе с цАМФ
5.3. Обсуждение результатов
5.3.1. Вопрос применимости данных, полученных на ß-субдомене к целому цАМФ-связывающему домену
5.3.2. Роль аминокислотного остатка в положении 209 в функционировании цАМФ-связывающего А-домена ПКА 1а
5.3.3. Электростатический «переключатель» R209-D170-R226 как механизм стабилизации конечных конформаций А-домена ПКА Ia, а не реализации конформационного перехода между ними
5.4. Промежуточные выводы
6. ХАРАКТЕРИСТИКА МЕХАНИЗМА ПЕРЕХОДА А-ДОМЕНА R-СУБЪЕДИПИЦЫ ПКА 1а ИЗ Н- В В-КОНФОРМАЦИЮ. РОЛЬ ГИДРОФОБНОГО И ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКОГО «ПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЕЙ» В ИЗМЕНЕНИИ КОНФОРМАЦИИ цАМФ-СВЯЗЫВАЮЩИХ ДОМЕНОВ
6.1. Оценка результатов моделирования Н—>В конформационного перехода для А-доменов дикого типа и с мутационной заменой R209K
6.2. Общая характеристика стадий и событий перехода А-домена из Н- в В-конформацию
6.3. Описание событий конформационного перехода А-домена из Н- в В-конформацню
6.3.1. События, в основе которых лежит конформацнонное изменение ФСК
6.3.2. События, в основе которых лежит конформацнонное изменение ША-мотива
6.3.3. События, в основе которых лежит конформацнонное изменение В/С-спирали
6.4. Описание первого приближения к пути минимальной свободной энергии (ПМСЭ) перехода А-домена из Н- в В-конформацию
6.5. Обсуждение результатов

В свете перечисленных фактов становится очевидна необходимость понимания механизма конформационных изменений цАМФ-связывающих доменов. Для разрешения этого вопроса сделано уже многое, но, тем не менее, не все. Так, предложено, что в передаче информации о связывании лиганда на удаленные от него структуры белка участвуют два «переключателя». В модели электростатического «переключателя» R209-D170-R226 придается значение электростатическим взаимодействиям между отрицательно заряженным лигандом и цАМФ-связывающим сайтом, имеющим на своей поверхности области положительного потенциала. Одному из остатков (R209), участвующему в создании положительного потенциала сайта и взаимодействующему напрямую с лигандом, отводится при этом ключевая роль в запуске конформационных изменений всего домена. К существенным недостаткам модели электростатического «переключателя» можно отнести ее несоответствие некоторым экспериментальным данным и отсутствие прямого доказательства, ее подтверждающего. Модель гидрофобного «переключателя» L203-Y229, напротив, описывает доказанную экспериментально связь между конформационными изменениями ФСК и В-спирали. Однако механизм, посредством которого связывание лиганда приводит к изменениям ФСК, остается в рамках этой модели вне рассмотрения.
Наше исследование направлено на устранение выявленных пробелов в понимании функционирования цАМФ-связывающих доменов. С использованием молекулярно-динамического моделирования мы оценили значение электростатического и гидрофобного «переключателей» в поддержании стабильности Н- и В-конформаций и в обеспечении перехода между ними. Также, мы предложили свою модель электростатического «переключателя», передающего информацию о связывании лиганда на гидрофобный «переключатель». И в завершение, мы охарактеризовали наиболее вероятную последовательность событий, лежащую в основе Н—»B конформационного перехода А-домена Ria. Построение профиля свободной энергии вдоль этой последовательности, которое планируется нами в дальнейшем, позволит перейти к объяснению взаимодействия Ria с С-субъеднницей и другими белками.