Создание аналогов субстратов системы эксцизионной репарации нуклеотидов и анализ их взаимодействия с белками клеточных экстрактов

• Автор: Евдокимов, Алексей Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Молекулярные механизмы действия системы ЫЕК

1.1. Узнавание повреждения

1.2. Проверка повреждения и сборка готового к удалению поврежденного участка комплекса

1.3. Удаление из ДНК фрагмента, содержащего повреждение

1.4. Репаративный синтез

2. Основные типы повреждений, репарируемых системой КЕЯ и модификации, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ СОЗДАНИЯ МОДЕЛЬНЫХ ДНК
2.1. Продукты УФ-облучения
2.2.Продукты воздействия химических загрязнителей окружающей среды
2.3. Продукты воздействия на ДНК компонентов лекарственных препаратов
2.4. Синтетические аналоги повреждений
3. МОДЕЛЬНЫЕ ДНК, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМА НУКЛЕОТИДНОЙ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ
3.1. Кольцевые ДНК с множественными повреждениями
3.2. Кольцевые ДНК с повреждением в заданной позиции цепи
3.3. Линейные ДНК с повреждением в заданной позиции цепи
3.4. ДНК-аналоги субстратов ЛЕЯ как зонды для аффинной модификации
3.5. Модельные ДНК и измерение эксцизионной активности системы ЛЕЯ
4. Заключение
МАТЕРИАЛЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ
МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ
1. Культивирование клеток НеЬа
2. Получение МЕЛ-компетентных клеточных экстрактов
3. Электрофорез в полиакриламидном геле
3.1. Гель-электрофорез в неденатурирующих условиях
3.2. Гель-электрофорез в денатурирующих условиях
4. Получение 1 37-звенных ДНК-дуплексов, содержащих модифицированный нуклеотид
4.1 Получение немодифицированной цепи ДНК длиной 137 п.н
4.2. Получение модифицированного дуплекса
4.3. Формирование модельных ДНК структур
4.4. Выделение модифицированного дуплекса
5. Фотоаффинная модификация белков с использованием Бар-оС-ДНК
6. Определение эффективности удаления модифицированного участка ДНК
6.1. Метод прямой детекции продуктов специфической эксцизии
6.2. Метод достройки продуктов специфической эксцизии с использованием а-[32Р]-с1ТР
7. Определение констант диссоциации комплекса ХРС-НЯ23в с ДНК
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Поиск эффективных субстратов ИЕЛ
1.1. Синтез серии протяженных ДНК, содержащих объемные аддукты

1.2. Оценка субстратных свойств полученных модельных ДНК
1.3. Оптимизация метода детекции эксцизионной активности NER
1.4. Доказательства специфичности метода детекции эксцизионной активности NER
1.5. Оценка чувствительности метода
2. Анализ свойств модельных ДНК
2.1. Определение температуры плавления модельных ДНК
2.2. Угол изгиба ДНК в районе повреждения
2.3. Эффективность взаимодействия модельных ДНК с XPC-HR23B
2.4. Моделирование молекулярной динамики модельных ДНК
3. Применение модельных ДНК
3.1. Фундаментальные аспекты применения модельных ДНК
3.1.1. Фотоаффинная модификация белков клеточного экстракта
3.1.2. Изучение влияния PARP1 на эффективность эксцизии повреждения в процессе NER
3.2. Варианты прикладного использования модельных ДНК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
AAF 2-ацетиламинофлюорен;
АР-сайт апуриновый/апиримидиновый сайт;
АТР аденозин-5'-трифосфат;
ADP аденозин-5'-дифосфат;
ВР бензо[а]пирен;
BP-dG (I )-^ис-бензо[а]пирен-.А/2-дезоксигуанидин;
BP-ДНК ДНК-дуплекс, содержащий (+)-1щс-бензо[а]пирен-А
дезоксигуанидин;
BER эксцизионная репарация оснований;
BSA бычий сывороточный альбумин;
Сеп2 Центрин 2;
Chol ненуклеозидная вставка содержащая в качестве объемного адцукта
остаток холестерина;
Chol-ДНК ДНК-дуплекс, содержащий в одной из цепей ненуклеозидную вставку
с остатком холистерина;
dNMP дезоксирибонуклеозид-5'-монофосфат;
dNTP дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат;
DTT дитиотреитол;
ERCC1 excision repair çross-çomplementing 1 ;
FAM флуоресцеин фосфорамидит;
Fap-dCTP экзо-Лт-{2-[Д'-(4-азидо-2,5- дифторо-3-хлорпиридин-6-ил)
аминопропионил] аминоэтил}-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат;
Fap-dC-ДНК ДНК-дуплекс, содержащий экзо-А-{2-[А-(4-азидо-2,5- дифторо
хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропионил] аминоэтил}-2'-дезоксицитидин;
Flu-dUTP флуоресцеин- 5(6)-карбоксиамидокапроил-[5-(3-аминоаллил)-2’-
дезоксиуридин 5’-трифосфат];
Flu-dU-ДНК ДНК-дуплекс, содержащий флуоресцеин- 5(6)-
карбоксиамидокапроил-[5-(3-аминоаллил)-2’-дезоксиуридин;
FRAP fluorescence recovery after photobleaching;
GG-NER общегеномная эксцизионная репарация нуклеотидов;
HhH домен спираль-шпилька спираль;
NAD никотинамидадениндинуклеотид;
nAnt А-[6-(9-антраценилкарбамоил)гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиол;
лиганда). Варьирование гетероциклических заместителей позволило выявить соединения с высокой противоопухолевой активностью [110]. Существенно более высокую активность, чем широко применяемые в практике цисплатин и оксалилплатин проявляет фенантриплатин, содержащий объемный лиганд фенантридин (с!а-| РЦ>1НЗ)2(фенантридин) С1]МОЗ). Отличается и проявляемый этим соединением спектр противоопухолевой активности, это означает, что фенантриплатин может оказаться активным в отношении типов раковых клеток, демонстрирующих устойчивость к обычной платиновой химиотерапии [111].
В последние годы внимание исследователей привлекли объемные аддукты, возникающие в результате взаимодействия с экзоциклическими аминогруппами пуриновых оснований ДНК реакционноспособных метаболитов аристолоховых кислот (МАК). Недавно было выявлено, что эти компоненты столетиями применяемых растительных лекарственных средств обладают серьезным токсическим эффектом и вызывают нефропатию, в 50% случаев приводящую к развитию рака [112]. Исследования, проведенные с использованием модельных ДНК, позволили установить, что образуемые МАК производные дезоксигуанозина удаляются из ДНК, в то время как аддукты дезоксиаденозина накапливаются в организме, что и приводит к заболеваниям [113].
Описано также использование модельных структур, содержащих модификации, возникающие при воздействии на ДНК компонентов гормональных препаратов типа премарина. Метаболиты конъюгированных эстрогенов, 4-гидроксиэкиленина и 4-гидроксиэкилина, использующихся в широко распространенных препаратах для гормон-заместительной терапии способны к автоокислению с образованием о-хинонов, активно взаимодействующих с азотистыми основаниями ДНК, преимущественно с цитозином, с образованием трудно репарируемых объемных аддуктов [114-116].
2.4. Синтетические аналоги повреждений
Примером неприродной объемной модификации является дезоксиуридин или дизокситимидин, в состав которого по С5 положению через линкерный фрагмент введен остаток флуоресцеина. Мономерное звено для синтеза таких ДНК является коммерчески доступным амидитом для стандартного твердофазного синтеза. Возможно также введение подобной модификации с помощью ДНК-полимеразной реакции с использованием модифицированного сШТР в качестве субстррата.
К категории искусственных аналогов повреждений относятся и недавно предложенные производные с!СМР и сШМР, содержащие фотоактивируемые арилазидные группировки, соединенные с азотистым основанием с помощью протяженных и гибких линкерных фрагментов [117]. Было показано, что такие арилазидные производные