Молекулярные механизмы противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов кукумариозида A2-2 и фрондозида A

• Автор: Менчинская, Екатерина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Тритерпеновые гликозиды

1.1.1. Химическое строение тритерпеновых гликозидов голотурий

1.1.2. Распространение тритерпеновых гликозидов в природе

1.1.3. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов голотурий

1.1.3.1. Цитотоксические свойства и противоопухолевая активность

тритерпеновых гликозидов

1.1.3.2. Влияние на множественную лекарственную устойчивость

1.1.3.3. Взаимодействие тритерпеновых гликозидов с биомембранами

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Исследуемые соединения
2.2. Лабораторные животные
2.3. Получение клеток
2.3.1. Получение клеток асцитной карциномы Эрлиха
2.3.2. Культивирование опухолевых клеток человека
2.4. Определение жизнеспособности клеток
2.4.1. Определение цитотоксической активности (окрашивание трипановым синим)
2.4.2. Измерение активности неспецифической эстеразы
2.4.3. Определение цитотоксической активности (МТТ тест)
2.5. Определение индукции апоптоза
2.5.1. Изучение инверсии фосфатидилсерина
2.5.2. Исследование индукции апоптоза в клетках асцитной карциномы Эрлиха с помощью
флуоресцентных зондов Р1 и Hoechst 33
2.5.3 Определение каспазы-3 и -9, PARP-
2.5.4. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии
2.5.5. Исследование влияния на активность белка р
2.6. Исследование клеточного цикла
2.6.1. Определение фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии
2.6.2. Определение включения 3Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток
2.7. Исследование колониеобразования опухолевых клеток
2.8. Определение множественной устойчивости
2.8.1. Исследование блокирования множественной лекарственной устойчивости с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM
2.8.2. Изучение динамики накопления доксорубицина в клетках асцитной карциномы Эрлиха.
2.8.3. Исследование выброса доксорубицина из опухолевых клеток
2.9. Протеомный анализ РСЗ клеток (2D-PAGE)
2.10. Верификация белков (2И-вестерн-блоттинг)
2.11. Функциональный анализ белков методами биоинформатики
2.12. Исследование противоопухолевой активности кукумариозида Аг-
в экспериментах in vivo
2.13. Влияние кукумариозида Aj-2 на противоопухолевую активность доксорубицина в экспериментах in vivo
2.14. Статистический анализ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Цитотоксическая активность тритерпеновых гликозидов
3.1.1. Определение жизнеспособности с помощью красителя трипаповый синий
3.1.2. Определение активности неспецифической эстеразы
3.1.3. Определение жизнеспособности опухолевых клеток с помощью метода МТТ
3.2. Изучение индукции апоптоза
3.2.1. Изучение инверсии фосфатиднлсерина
3.2.2. Исследование конденсации хроматина
3.2.3. Исследование активности казпазы-3, -9 и PARP-
3.2.4. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии
3.2.5. Влияние на активность белка р
3.3. Исследование клеточного цикла
3.3.1. Определение фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии
3.3.2. Определение включения 3Н-тимидина в ДНК клеток
3.4 Влияние тритерпеновых гликозидов на колониеобразование опухолевых клеток
3.5. Исследование влияния кукумариозида Аг-2 и фрондозида А на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток
3.5.1. Изучение множественной лекарственной устойчивости с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM
3.5.2. Изучение транспорта доксорубицина в опухолевых клетках
3.6. Исследование влияния тритерпеновых гликозидов на протеом опухолевых клеток человека
3.6.1. Протеомный анализ белков с помощью 2D-PAGE и MALDI-MS
3.6.2. Биоинформационный анализ
3.6.3. Верификация экспрессии белков методом вестсрн-блоттинг и 20-вестерн блоттинг.
3.7. Исследование противоопухолевой активности кукумариозида Аг-2 in vivo
3.8. Влияние кукумариозида Аг-2 на противоопухолевую активность доксорубицина in vivo
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

2.5. Определение индукции апоптоза
2.5.1. Изучение инверсии фосфатиднлсернна
Суспензию клеток асцитной карциномы Эрлиха инкубировали в 24-луночных планшетах в среде RPMI-1640, содержащей раствор L-глютамина (2 мМ), гентамицина (50 мкг/мл) и раствор кукумариозида Аг-2 или фрондозида А. Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе при 37°С на протяжении определенного времени (1-24 ч). Для измерения количества фосфатиднлсернна на поверхности клеток использовали стандартные тест-наборы (ApoTarget Annexin-V F1TC Apoptosis Kit, Molecular Probes, США). Процедура измерения проводилась согласно протоколу производителя. После инкубирования клетки осаждали путем центрифугирования при 1500 об/мин 5 мин и полученный осадок ресуспендировали в Annexin V связывающем буферном растворе (100 мкл), содержащем 10 мМ HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 мМ NaCl, 2.5 мМ СаСЬ. Затем аликвоту (100 мкл) клеточной суспензии помещали в пробирку для FACS анализа, добавляли 5 мкл раствора зонда Annexin V-F1TC и 5 мкл раствора зонда PI, и инкубировали при комнатной температуре в темноте 15 мин.
Анализ клеток, вступивших в апоптоз, проводили методом проточной флуоресцентной цитометрии на лазерном клеточном анализаторе FACS Calibur (“Becton Dickinson”, США), используя программное обеспечение BD CellQuest Pro. Процентное содержание апоптотических клеток определяли по двумерному графику (дот-плот) с использованием программы WinMDI 2.9 (Joseph Trotter), рассчитывая количество клеток с увеличенным содержанием фосфатидилсерина на поверхности мембран, интенсивно окрашиваемых зондом Annexin V-FITC (ранний апоптоз) и клеток, одновременно интенсивно окрашиваемых зондами Annexin V-FITC и PI (поздний апоптоз/некроз).
2.5.2. Исследование индукции апоптоза в клетках асцитной карциномы Эрлиха с помощью флуоресцентных зондов PI и Hoechst 33
После инкубирования клеток асцитной карциномы Эрлиха с исследуемыми веществами в 96-луночных планшетах в течение определенного времени в каждую лунку добавляли по 20 мкл раствора зонда Hoechst 33342 (Molecular Probes, США, 10 мкМ конечная концентрация). Затем к этой суспензии клеток добавляли раствор PI (Molecular Probes, США, 50 мкг/мл конечная концентрация). Микропланшеты ставили на инкубирование в течение 10 мин в термостат при 37°С. Затем отбирали по 100 мкл суспензии в камеру для анализа изображения клеток и анализировали флуоресценцию клеток с помощью инвертированного флуоресцентного