Диссимиляционная нитратредукция у представителей серобактерий рода Thiothrix : очистка и характеристика респираторной нитратредуктазы, скрининг генов, участвующих в процессах денитрификации

• Автор: Трубицин, Иван Васильевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Денитрификация

1.1.1. Общая характеристика процесса

1Л .2. Молекулярно-биологические аспекты дыхания на нитратах

1.1.3. Нитратное дыхание

1.1.3.1. Нитратредуктазы прокариот

1Л .3.1.1 .Определение, классификация

1.1.3.1.2. Каталитические свойства. Механизм восстановления нитрата до нитрита

1.1.3.1.3. Клеточная локализация
1.1.3.1.4. Ассимиляционные нитратредуктазы
1.1.3.1.5. Диссимиляционные нитратредуктазы
1.1.3.1.5.1. Мембраносвязанная респираторная нитратредуктаза
1.1.3.1.5.2. Периплазматическая нитратредуктаза
1.1.4. Транспорт нитратов
1.1.5. Дыхание на нитритах. Нитритредуктазы
1.1.6. N0- и ШО-редуктазы
1.2. Диссимиляционная нитратредукция до аммония
1.3. АНАММОКС
1.4. Диссимиляционная нитратредуктаза ЫагОШ
1.4.1. Распространение
1.4.2. Функции
1.4.3. Особенности структурной организации

1.4.4. Физико-химические свойства
1.4.5. Устройство генного кластера паг, сборка фермента, регуляция экспрессии
1.5. Характеристика рода Thiothrix
1.5.1. Таксономический состав и филогенетическое положение
1.5.2. Экология
1.6. Заключение по обзору литературы
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы, приборы, реактивы, инретнет-ресурсы
2.1.1. Использованные реактивы
2.1.2. Буферные растворы и реакционные смеси
2.1.3. Препараты ДНК
2.1.4. Белковые маркеры
2.1.5. Оборудование, программы, интернет-ресурсы
2.1.5.1. Оборудование
2.1.5.2. Программы и интернет-ресурсы
2.2. Микроорганизмы и их культивирование
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2. Состав сред и условия культивирования
2.3. Молекулярно-биологические методы
2.3.1. Выделение геномной ДНК
2.3.2. ПЦР-амплификация ДНК
2.3.3. Очистка фрагментов ПЦР с помощью препаративного электрофорезаб
2.3.4. Выделение суммарной клеточной фракции РНК
2.3.5. Получение кДНК-копий (реакция обратной транскрипции) и ОТ-ПЦР

2.3.6. Определение нуклеотидной последовательности
2.3.7. Построение филогенетического дерева
2.4. Химические методы анализа
2.4.1. Анализ анионов
2.5. Методы определения активности ферментов
2.5.1. Определение активности нитратредуктазы
2.5.1.1. Получение бесклеточного экстракта
2.5.1.2. Определение активности нитратредуктазы
2.6. Очистка и характеристика респираторной нитратредуктазы
2.6.1. Очистка фермента
2.6.2. Определение молекулярной массы нативного препарата респираторной нитратредуктазы
2.6.3. Определение молекулярной массы субъединиц
2.6.4. Определение оптимума pH, температурного оптимума и термостабильности
2.6.5. Определение кинетических свойств нитратредуктазы NarGHI
2.7. Определение концентрации белка
2.8. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Биохимия нитратного дыхания у представителей серобактерий рода Thiothrix
3.1.1. Анаэробный рост и динамика восстановления нитратов и образования нитритов при анаэробном дыхании на нитратах
3.1.2. Определение активности диссимиляционной нитратредуктазы
3.1.3. Очистка и характеристика респираторной нитратредуктазы
Т. lacustris AS
3.1.3.1. Очистка респираторной нитратредуктазы NarGHI

Рис. 13. Ферменты, осуществляющие АНАММОКС и общая схема процесса (вітош е/ а1., 2006).
СуХ Ьс— цитохром Ьс комплекс , №г - нитритредуктаза, НН - гидразингидролаза, №0 / НАО - гидразин / гидроксиламиноксидоредуктаза , <3 - кофермент О.
Из электронтранспортной цепи на уровне цитохрома Ьс электроныпопадают на нитритредуктазу и гидразингидролазу. При этом нитритредуктаза восстанавливает нитриты до монооксида азота, который является продуктом для следующей реакции. Гидразингидролаза, также получив электроны из ЭТЦ, образует из N0 и ЫН./ молекулу гидразина.
1.4. Диссимиляционная нитратредуктаза ІМагОНІ
1.4.1. Распространение
Диссимиляционная нитратредуктаза ЫагСШ (К.Ф. 1.7.5.1.),
бактериальный фермент, катализирующий реакцию двухэлектронного восстановления атома азота в молекуле нитрата.
Диссимиляционная нитратредуктаза ИагОНІ - фермент, широко распространенный среди прокариот (табл.1). Поскольку данная нитратредуктаза является необходимым компонентом метаболического пути