Роль кардиолипина в функционировании мембранных белковых комплексов Escherichia coli

• Автор: Иванова, Вилена Витальевна
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 122 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ

ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура и функции фосфолипидов бактериальных мембран

1.2. Функция кардиолипина в биологических мембранах

1.3. Синтез кардиолипина у прокариот и эукариот

1.4. Структура и стабильность комплекса II электрон-транспортной цепи

1.5. Структура и функции транслоконовой системы SecYEG

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Оборудование и реактивы
2.2. Объекты исследования
2.2.1. Использованные штаммы микроорганизмов и плазмиды
2.3. Методы, использованные в работе
2.3.1. Культивирование микроорганизмов
2.3.2. Мечение и экстракция фосфолипидов
2.3.3. Одномерная тонкослойная хроматография фосфолипидов
2.3.4. Двумерная тонкослойная хроматография фосфолипидов
2.3.5. Получение полного клеточного лизата E.coli
2.3.6. Получение мембранного экстракта E.coli
2.3.7. Выделение внутренних мембран E.coli
2.3.8. Солюбилизация мембранных комплексов и голубой нативный ПААГ электрофорез
2.3.9. Денатурирующий электрофорез мембранных белков в

2.3.10. Вестерн-блот
2.3.11. Определение активности щелочной фосфатазы
2.3.12. Измерение клеточного pH E.coli
2.3.13 Статистический анализ данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Определение ориентации активных центров кардиолпинсинтаз во ^ внутренней мембране E.coli
3.2. Роль кардиолипина в организации комплекса II E.coli
3.3. Роль кардиолипина в стабильности и активности транслокона SecYEG/SecA
3.4. Стабильность комплекса SecYEG в зависимости от уровня кардиолипина в мембранах E.coli
3.5. Роль кардиолипина в сборке порина OrapF E.coli
3.6. Роль кардиолипина в функционировании щелочной фосфатазы E.coli
3.7. Влияние кардиолипина на транслокацию и сборку пермеазы лактозы 0„ LacY
3.8. Роль кардиолипина в регулировании цитоплазматического pH E.coli
4 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Ориентация активных центров кардиолипинсинтаз E.coli ^
4.2. Кардиолипин влияет на ассоциацию субъединиц комплекса II дыхательной цепи E.coli в суперкомплекс и на энергетический обмен
4.3. Кардиолипин стабилизирует димерную форму транслокона SecYEG
4.4. Активность транслоконовой системы SecYEG зависит от образования суперкомплекса, стабилизируемого кардиолипином
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
1. АТ - антитела
2. ДДМ - додецилмальтозид
3. ДФМ - дифосфатидилманитол
4. КЛ - кардиолипин
5. ЛБ - среда Лурия-Бертани
6. ГТААГ - полиакриламидный гель
7. ТСХ - тонкослойная хроматография
8. ФГ - фосфатидилглицерин
9. ФМ - фосфатидилманнитол
10. ФС - фосфатидилсерин
11. ФЭ - фосфатидилэтаноламин
12. ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
13. СЬА - кардиолипинсинтаза А
14. С1эВ - кардиолипинсинтаза В
15. СЬС- кардиолипинсинтаза С
16. БССР- карбонил цианид 4-трифлуорометокси фенилгидразон
17. 9АА - 9-аминоакридин

катализирует окисление сукцината до фумарата с восстановлением убихинона до убихинола благодаря сопряжению двух реакций [Eletsky et ah, 2012].
Сукцинат дегидрогеназа состоит из четырех субъединиц. Первые две субъединицы, флавопротеин (SdhA) и железо-серный белок (SdhB) являются гидрофильными. SdhA содержит ковалентно связанный
флавинадениндинуклеотид (ФАД+) кофактор и сукцинат связывающий сайт, в то время как SdhB составляет три железо-серных кластера - [2Fe-2S], [4Fe-4S] и [3Fe-4S]. Гидрофобные субъединицы - SdhC и SdhD, закреплены в мембране [Oyedotun and Lemire, 2004].
Флавопротеин имеет молекулярную массу 65 кДа, содержит ковалентно связанный ФАД+ в качестве кофактора и активный центр, связывающий субстрат - сукцинат. Меньшая субъединица - железо-серный белок, расположенный линейно между флавином и каталитическим центром хинона. Субъединица SdhA соединяется с SdhB на гидрофильном и каталитическом конце комплекса. Электроны, удаляемые с сукцината, перемещаются на данную субъединицу, а затем через SdhB на SdhC и SdhD, расположенные в мембране. Далее электроны поступают на убихинон. SdhA превращает сукцинат в фумарат в цикле Кребса и также окисляет ФАД-Н2 до ФАД+ в процессе окислительного фосфорилирования [Lancaster and Kroger, 2000].
Растворимая часть прикреплена к мембране благодаря гидрофобному мембранному «якорю». В зависимости от типа мембранного домена ферменты комплекса II делятся на содержащие одну или две субъединицы, взаимодействующие предпочтительно с убихиноном, менахиноном или — родохиноном, а также—различающиеся -количеством групп гема b (не содержащие, содержащие 1 или 2). У ферментов, не содержащих или содержащих 1 группа гема, гидрофобный сегмент делится на две трансмембранные субъединицы (SdhC и SdhD по 12-15 кДа) [Tran et а!., 2007].