Роль системы токсин-антитоксин vapBC в формировании состояния покоя Mycobacterium smegmatis

• Автор: Демидёнок, Оксана Игоревна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Состояние покоя у бактерий
2. Системы токсин-антитоксин бактерий
2.1. Типы ТА систем
2.2. Распространение ТА систем
2.3. Мишени токсинов
2.4. Функции ТА систем
3. ТА системы микобактерий
3.1. Семейство mazEF
3.2. Семейство relBE
3.3. Семейство Phd/Doc
3.4. Семейство parDE
3.5. Семейство higBA
3.6. Трёхкомпонентная ТА система ТАС
3.7. Семейство vapBC
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Объекты исследования. Штаммы и контрукции
2. Условия культивирования
3. Клонирование
4. Трансформация культур M.smegmatis и E. coli
5. Электрофорез в агарозном геле
6. Получение мутантного штамма с делецией локуса vapBC
7. Отбор позитивных в отношении экспрессии токсина VapC колоний
8. Получение покоящихся форм М. smegmatis
9. Микроскопические исследования
10. Оценка культивируемости
11. Реактивация «некультивируемых» клеток
12. Включение радиоактивной метки
13. Определение дыхательной активности
14. Изучение чувствительности клеток к действию стрессовых
факторов
15. Получение рекомбинантного белка УарС
16. Получение рекомбинантного белка Яр15т
17. Электрофорез рекомбинантных белков УарС и ЯрКт в ПААГ
18. Иммунизация и ммуноблоттинг рекомбинантного белка УарС
19. Выделение и очистка РНК
20. ПЦР в реальном времени
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Образование покоящихся форм рекомбинантным штаммом
М^тедта^ иД: - рМтй - vapC сгиперэкспрессией токсина

2. Биохимические свойства овоидных форм рекомбинантного штамма иЧ
- рМтй - гарС М. БтедтаИБ
3. Изменение уровня экспрессии гена уорС при переходе клеток
Л/.хтедшог/х штамма дикого типа в покоящееся состояние
4. Гиперэкспрессия антитоксина УарВ препятствует образованию
покоящегося состояния клетками М.этедтаИз
5. Получение мутантного штамма ЛуарВСМ. втедтаЫз с делецией локуса

6. Гиперэкспрессия антитоксина УарВ препятствует переходу клеток
делеционного штамма ЛуарВСв покоящееся состояние
7. Получение покоящихся форм штамма - рМшй -уарВСМ. зтедтай'х с
комплементацией делеции локуса уарВС
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
КОЕ - колониеобразующие единицы NB - Nutrient broth, мясо-пептонный бульон
mHdB - модифицированная синтетическая среда Hartman’s-de Bont
БСА - бычий сывороточный альбумин
МКР - метод конечных разведений
НВЧК- наиболее вероятное число клеток
ТА - токсин-антитоксин
НК - «некультивируемые» клетки
OÜ6oo-оптическая плотность при длине волны 600 нм
PI - propidium iodide, флуоресцентный краситель, детектирующий поврежденные клетки
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ВВ - binding buffer, связывающий буфер
ИПТГ - (англ. IPTG - isopropylthiogalactoside), изопропил-ß-D-l-тиогалактопиранозид
ПААГ - полиакриламидный гель
TBS - Tris-Buffered Saline, солевой трис-буфер
МЛУ - множественная лекарственная устойчивость
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПКС - программируемая клеточная смерть
Rpf - Resuscitation promoting factor, фактор, способствующий реактивации покоящися форм бактерий

3. ТА системы микобактерий.
Клетки МТВ обладают способность длительное время существовать в организме хозяина в неактивном дормантном состоянии, с чем многие исследователи связывают не только формирование латентной стадии туберкулёза, длительный период лечения, но и рецидивы этого заболевания после окончания процедур лечения. Вероятно, это может быть связано с наличием ТА систем, широко представленных в хромосоме туберкулёзного агента (таб. 3].
Таблица 1. ТА системы в геномах различных микобактерий [Sala A. etal., 2014]
Геном vapBC mazEF relBE parDE yefM/ higBA TAC Другие1"' всего
МТВ 50 10 2 2 yeM 2 1 11
M.smegmat ismc2155 1 1 1" 2
M.inarimim М 1 і
M.avium 104 1 2
M.avium
paratuberc 1 1 1
il Insis K
M.abscessu
SA TCC 1 7

M.ulcerans Agy99 1 1 ’
M.gilvum PYR-GCK 3 1 1 9
6 ТА системы, не классифицированные по типу;
в ТАС система М. smegmatis не полная вследствие отсутствия гена токсина.
В геноме МТВ H37Rv было обнаружено 79 ТА систем: 67 их них относятся к 6 хорошо известным семействам II типа: vapBC (50 систмем), mazEF (10 систем), по две системы relBE, higBA, rapDE и одна уе/М/уоеВ. Кроме того, в геноме МТВ были обнаружены одна трёхкомпонентная ТА система (ТАС), активность которой контролируется SecB - подобным шапероном, 3 потенциальные ТА системы IV типа и 8 ТА систем, не относящихся ни к одному известному на сегодняшний день типу [Sala A. et al., 2014]
3.1. Семейство mazEF.
Гены данного семейства локусов были обнаружены одними из первых (Masuda et.al., 1993). На сегодняшний день механизм действия, регуляции,