Сравнительный анализ функции альфа- и гамма-синуклеинов в синаптических везикулах

• Автор: Лыткина, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Семейство белков синуклеинов

1.1.2 Альфа-синуклеин

1.1.3 Гамма-синуклеин

1.2 SNARE белки

1.2.1 Синтаксин-

1.2.3 SNAP-

1.2.2 Синаптобревин-2/УАМР

1.2.4 Нейрональный SNARE-комплекс

1.3 Роль альфа-синуклсина в регуляции формирования SNARE-
комплекса
1.4 Недостаточность альфа-синуклеина, как фактор развития
синаптической дисфункции
1.5 Моделирование синаптической дисфункции в CSP-a нокаутных
мышах
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Экспериментальные животные
2.2 Биохимические методы анализа
2.2.1 Генотипирование нокаутных животных
2.2.2 11ЦР в реальном времени
2.2.3 Получение синаптических везикул
2.2.4 Денатурирующий электрофорез в ПААГ
2.2.5 Иммуноблоттинг
2.2.6 Получение рекомбинантных синуклеинов
2.2.6.1 Клонирование
2.2.6.2 Продукция рекомбинантных синуклеинов в бактериальных системах
2.2.6.3 Очистка рекомбинантных синуклеинов из бактериального штамма-производителя
2.2.7 Клеточные культуры
2.2.7.1 Приготовление культуральных сред
2.2.12 Ведение клеточных культур
2.2.12 Дифференцировка клеточной культуры 8Н-8У5У
Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1 Получение линии бессинуклеиновых мышей
3.1.1 Получение линии двойного нокаута по генам альфа- и гамма-синуклеинов
3.1.2 Получение линии бессинуклеиновых животных - тройного нокаута по генам альфа-, бета- и гамма-синуклеинов
3.1.3 Подтверждение отсутствия всех трех белков синуклеинов в тканях мышей линии а!^-КО
3.2 Анализ связывания рекомбинантного гамма-синуклеина с синаптическими везикулами
3.2.1 Получение рекомбинантных синуклеинов
3.2.2 Связывание рекомбинантных синуклеинов с синаптическими везикулами
3.3 Анализ связывания рекомбинантного гамма-синуклеина с белками 8МА1ГЕ-комплекса

3.3.1 Получение рекомбинантных 08Т-конъюгированных синуклеинов
3.3.2 Анализ связывания рекомбинантных СБТ-конъюгированных синуклеинов с белками 8КАИЕ-комплекса
3.3.2.1 Связывание синуклеинов с синаптобрсвином-2/УАМР
3.3.2.2 Связывание синуклеинов с синтаксином-
3.3.2.3 Связывание синуклеинов с 8ЫАР-
3.3.2.4 Роль С-концевого домена альфа-синуклеина в связывании с белками 8КАЯЕ-комплекса
3.4 Исследование эффекта повышенной продукции гамма-синуклеина на дегенерацию синапсов, вызванную нарушением функции С8Р-а
3.4.1 Получение повышенной экспрессии гамма-синуклеина в нервной системе С8Р-а нокаутных мышей
3.4.2 Повышенная экспрессия экзогенного гамма-синуклеина в нервной системе С8Р-а нокаутных мышей не влияет на прогрессию нейродегенеративного процесса
3.4.3 Анализ уровня гамма-синуклеина в синаптических везикулах С8Р-а'л/ ТЬу 1 ту1® мышей
3.5 Гамма-синуклеин в дифференцированной по нейрональному типу культуре клеток нейробластомы человека 8Н-8У5У
Выводы
Список литературы

эффективность нейротрансмиссии, вследствие чего развиваются серьезные нейродегенеративные изменения, и животные погибают практически все к двухмесячному возрасту [44]. Эксперименты, проведенные на синапсах чашечек Хелда, позволяющие изучать пресинаптические функции в высоком разрешении, благодаря крупным размерам данных синапсов, показали, что к одиннадцатому дню постанального развития у мышей, нокаутные по CSP-a, не было выявлено нарушений в работе синапсов. Однако, уже к двадцатому дню жизни фиксировались значительные ухудшения в нейротрансмиссии и были выявлены выраженные признаки нейродегенерации [44]. Известно, что мутации в домене DNAJ5 белка CSP-а у человека приводят к нейронному восковидному липофусцинозу -нейродегенеративному расстройству, характеризующемуся деменцией, судорогами, аккумуляцией белков с неправильной конформацией в лизосомах [99].
Биохимический анализ лизатов мозга мышей, нокаутных по CSP-a, показал, что количество белка SNAP-25 уменьшается примерно на 40% и на 50% уменьшается сборка SNARE комплексов [28; 123]. Снижение уровня белка SNAP-25 в нокаутных по CSP-a мышах происходит на фоне активации убиквитинизации SNAP-25 и его ускоренной деградации [123]. Показано, что простое снижение экспрессии белка SNAP-25 в нокаутных мышах, которое имеет место при гетерозиготном состоянии, не приводит к развитию нейродегенерации. В нокаутных же по CSP-a мьтшах нарушается сборка SNARE комплекса и развивается серьезная нейродегенерация. Шаперонный комплекс CSP-a/Hsc70/SGT предотвращает мисфолдинг белка SNAP-25 in vitro, что является основным доказывом шаперонной активности белка CSP-a по отношению к SNAP-25 [123].