Системная красная волчанка: антитела, гидролизующие основной белок миелина

• Автор: Тимофеева, Анна Михайловна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 132 с. : ил.

Список сокращений
АГ - антиген
АИЗ - аутоиммунные заболевания
АИТ - аутоиммунный тиреоидит
АК - аминокислота
АМФ - аденозин монофосфат
АТ - антитела
АТФ - аденозин трифосфат
БСА - бычий сывороточный альбумин
б-ДНКаза - ДНКаза I быка
дсДНК - двуспиральная ДНК
ДТТ - дитиотреитол
ИН - интеграза
ИФА - иммуноферментный анализ
КТ - компьютерная томография
МРТ - магнитно-резонансная томография
МЛЦ - моноклональные легкие цепи
ОБМ - основной белок миелина
ОП - олигопептид
ОФХ — обращено-фазовая хроматография
ПААТ - полиакриламидный гель
ПНС - периферическая нервная система
ПЭГ — полиэтиленгликоль
PC - рассеянный склероз
СКВ - системная красная волчанка
СККМ - стволовые клетки костного мозга
ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин
ТМБ - 3, 3’, 5, 5’-тетраметилбензидин
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан
ТСХ - тонкослойная хроматография
ТФУ - трифторуксусная кислота
УА - удельная активность
ФД - фаговый дисплей
ЦНС — центральная нервная система

ЧСА - человеческий сывороточный альбумин ч-ДНКаза - ДНКаза I человека
ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты AEBSF - 4-(2-аминоэтил)бензенсульфонилфлиоридгидрохлорид CMV - вирус мозаики огурцов
dNTPmlx - смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов IPTG - изопропил-бета-О-тиогалактозид NTA - нитрилотриуксусная кислота
MALDI-TOF-MS - Matrix Assisted Laser Desorption'Ionization (Лазерная десорбционная ионизация в присутствии матрицы) Time Of Flight Mass-Spectrometry (время пролетная масс-спектрометрия)
MCA - метилкумаринамид
MES - 2-морфолиноэтил-сульфокислота
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
ММР - матриксная металлопротеаза
MOPS - 3-(]М-морфолино)пропансульфоновая кислота
SDS - додецилсульфат натрия
VIP - интестинальный вазоактивный нейропептид
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Рассеянный склероз
1.1.1. Клеточная и молекулярная патоморфология очагов демиелинизации
1.2. Строение и функции миелина
1.2.1. Основной белок миелина
1.3. Системная красная волчанка
1.3.1. Иммунные процессы при СКВ
1.3.2. Основные неврологические синдромы, развивающиеся на фоне СКВ
1.3.3. Демиелинизирующие аутоиммунные заболевания
1.4. Каталитически активные антитела
1.4.1. Природные абзимы с различными каталитическими активностями
1.4.2. Природные абзимы с протеолитической активностью
1.4.3. Роль природных абзимов в организме
1.4.4. Возможные механизмы генерации природных абзимов
1.5. Разнообразие каталитически активных АТ
1.5.1. Каталитическая и аффинная гетерогенность абзимов
1.5.2. Субстратная полиспецифичность абзимов
1.5.3. Зависимость от pH реакционной среды и ионов двухвалентных металлов
1.6. Фаговый дисплей
1.6.1. Биология нитевидного бактериофага
1.6.2. Типы векторных систем на основе нитчатых бактериофагов
1.6.3. Основные методические этапы фагового дисплея
1.6.4. Типы фаговых библиотек антител
1.6.5. Проблемы и успехи дисплея на основе нитчатых бактериофагов
1.6.6. Каталитически активные легкие цепи антител
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Реактивы и материалы
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение из плазмы крови
2.2.2. Фракционирование ^0 в зависимости от подкласса легкой и тяжелой цепи
2.2.3. Тестирование АТ к ОБМ в плазме крови с помощью ИФА
2.2.4. Электрофоретический анализ белков

Уменьшение протеолитической активности IgG и IgM больных PC наблюдается в случае использования ингибиторов сериновых протеаз и ЭДТА. Эффекты специфических ингибиторов на IgG больных PC значительно различаются от пациента к пациенту [19-23].
Наиболее поразительные результаты были получены для АТ ВИЧ-инфицированных пациентов, в частности в гидролизе вирусной интегразы. Анти-интегразные IgG содержали каталитически активные АТ четырех типов: тиоловые, сериновые, кислые и металл зависимые, соотношение которых было индивидуальным для каждого пациента [123-125].
1.5.1. Каталитическая и аффинная гетерогенность абзимов
Канонические ферменты обычно катализируют только одну химическую реакцию [122]. Например. ДНКазы гидролизуют только ДНК и неактивны в гидролизе РНК. Интересно, что поликлональные IgG, IgA и IgM больных некоторыми АИЗ, вирусными заболеваниями и молока человека обладают как ДНКазной, так и РНКазной активностью, и их относительная активность в гидролизе РНК часто значительно выше, чем ДНК [3-13, 66-73]. Более того, несколько различных моноклональных IgG против различных последовательностей В-ДНК, полученные с использованием СКВ-линии мышей, в ~30-100 раз быстрее гидролизовали РНК, чем ДНК [68].
Как было указано выше, иммунизация здоровых кроликов с помощью ДНК, РНК, ДНКазы и РНКазы приводит к образованию АТ, гидролизующих как ДНК, так и РНК [154-158]. При этом скорость гидролиза РНК примерно в 100-1000 раз выше, чем ДНК.
ДНК- и РНК-гидролизующие АТ пациентов с АИЗ, как правило, очень разнородны по сродству к ДНК и могут быть разделены на несколько фракций хроматографией на ДНК-целлюлозе [3-13, 66-73]. Кроме того, ДНК-целлюлоза взаимодействует не только с анти-ДНК АТ, но и с АТ против фосфолипидов, полисахаридов, белков клеточной поверхности и т.д., демонстрируя перекрестную реактивность с ДНК [3-13, 66-73]. Аффинная хроматография IgG кроликов, иммунизированных ДНК, на ДНК-целлюлозе привела к разделению поликлональных АТ на фракции, гидролизующие как РНК, так и ДНК, а также впервые обнаружены фракции, гидролизующие только РНК.
Недавно было показано, что один из препаратов моноклональных АТ против вируса мозаики огурцов (CMV) эффективно взаимодействует с РНК, ДНК и белками и обладает протеолитической, ДНКазной и РНКазной активностями [185]. Следует отметить, что вирус имеет сложную структуру; он включает в себя липиды, полисахариды и белки. В данном случае пока непонятно, молекулами какой природы сформирована антигенная