Применение рекомбинантного гистона H1.3 для вирусного и невирусного переноса нуклеиновых кислот в культуре клеток

• Автор: Соловьева, Валерия Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 164 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Гистонные белки
1.1.1 Нуклеосомные гистоны
1.1.2 Линкерный гистон Н1 и его варианты
1.2 Рекомбинантный гистон Н1.
1.3 Методы переноса нуклеиновых кислот в клетки
1.3.1 Вирусные методы переноса нуклеиновых кислот
1.3.1.1 Векторы на основе аденовирусов
1.3.1.2 Векторы на основе адено-ассоциированных вирусов
1.3.1.3 Векторы на основе вируса простого герпеса
1.3.1.4 Векторы на основе ретровирусов
1.3.1.5 Векторы на основе поксвирусов и другие вирусные векторы
1.3.2 Невирусные методы переноса нуклеиновых кислот
1.3.2.1 Физические методы доставки нуклеиновых кислот
1.3.2.2 Химические методы доставки нуклеиновых кислот
1.4 Гистонофекция
1.4.1 Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот с помощью гистонов и других ядерных белков
1.4.1.1 Трансфекция с помощью линкерного гистона Н
1.4.1.2 Трансфекция с помощью нуклеосомных гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4
1.4.1.3 Трансфекция с помощью гистоноподобных белков и пептидов неэукариотического происхождения
1.4.1.4 Трансфекция с помощью негистонных ядерных белков
1.4.1.5 Безопасность доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот с помощью гистонных и других ядерных белков
1.4.2 Механизм доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот с помощью гистонов
1.4.3 Комбинированные системы доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки
1.5 Заключение по обзору литературы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Комплексообразование нуклеиновых кислот и рекомбинантного гистона Н1.
2.1.1 Приготовление комплексов плазмидной ДНК и гистона Н1.3 для электрофоретических исследований

2.1.2 Приготовление комплексов гистона Н1.3 и плДНК/Н1.3 для MTS-теста
2.1.3 Приготовление комплексов плДНК/Н1.3 для определения жизнеспособности клеток окрашиванием Акридиновым оранжевым/Бромистым этидием
2.1.4 Определение дзета-потенциала комплексов плДНК/Н1.
2.2 Методы работы с нуклеиновыми кислотами
2.2.1 Электрофорез в агарозном геле
2.2.2 Выделение нуклеиновых кислот (плазмидной ДНК)
2.2.3 Субклонирование гена улучшенного зеленого флуоресцентного белка в аденовирусный плазмидный вектор по технологии Gateway®
2.2.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.2.5 Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами
2.2.6 Очистка проб после рестрикционного расщепления
2.3 Методы работы с прокариотическими клетками
2.3.1 Культивирование бактериальных клеток
2.3.2 Трансформация бактериальных клеток
2.3.3 Криоконсервация бактериальных клеток
2.4 Методы работы с эукариотическими клетками
2.4.1 Клеточные культуры, культивирование
2.4.2 Процедура пассирования клеточных культур
2.4.3 Криоконсервация клеточных культур
2.5 Оценка жизнеспособности культур клеток in vitro
2.5.1 Оценка активности митохондриальных дегидрогеназ в кульурах клеток in vitro
2.5.2 Определение жизнеспособности клеток с помощью окрашивания Акридиновым оранжевым/Бромистым этидием
2.6 Получение рекомбинантных вирусов
2.6.1 Получение рекомбинантного летнивируса, экспрессирующего репортерный ген зеленого флуоресцентного белка
2.6.2 Получение рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего репортерный ген улучшенного зеленого флуоресцентного белка EGFP
2.6.2.1 Получение плазмидного аденовирусного вектора, экспрессирующего ген 66 2.6.22 Получение рекомбинантых аденовирусных частиц в пакующей линии клеток
2.6.2.3 Определение титра рекомбинантного аденовируса
2.7 Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки (трансфекция и вирусная трансдукция)
2.7.1 Трансдукция клеточных культур рекомбинантными вирусами

2.7.1.1 Трансдукция клеток HeLa рекомбинантным лентивирусом
2.7.1.2 Влияние рекомбинантного гистона Н1.3 на эффективноть лентивирусной или аденовирусной трансдукции
2.7.2 Кальций-фосфатный метод трансфекции
2.7.2.1 Ко-трансфекция пакующей линии клеток НЕК293Т для продуктции рекомбинантных лентивирусных частиц
2.12.2 Влияние рекомбинантного гистона Н1.3 на эффективность кальций-фосфатного метода трансфекции
2.7.3 Трансфекция клеточных культур с помощью комплексов нуклеиновых кислот и гистона Н1.
2.7.3.1 Трансфекция клеточных культур с помощью комплексов плДНК/Н1.
2.7.3.2 Трансфекция клеток HeLa-GFP с помощью комплексов киРНК/Н1.3
2.7.4 Химическая трансфекция с использованием катионных липидов и катионных полимеров
2.7.4.1 Трансфекционный агент TransFast
2.7.4.2 Трансфекционный агент TurboFect
2.7.5 Анализ эффективности трансфекции
2.7.5.1 Микроскопия клеток
2.1.5.2 Проточная цитофлуориметрия
2.8 Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Исследование взаимодействия рекомбинантного гистона Н1.3 и нуклеиновых кислот in vitro
3.2 Определение цитотоксичности рекомбинантного гистона Н1.3 и его комплексов с нуклеиновыми кислотами в культуре клеток in vitro
3.3 Применение рекомбинантного гистона Н1.3 в качестве вектора доставки нуклеиновых кислот в культуре клеток
3.4 Применение рекомбинантного гистона Н1.3 в комбинации с другими
методами доставки нуклеиновых кислот in vitro
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

концевого фрагмента гистона Н2А незначительно сказывается на его трансфекцинной активности (Balicki et al., 2002), а С-концевой фрагмент гистона Н1 играет важную роль в Н1-опосредованной трансфекции. Мутации или удаление N-концевой части гистона Н2А приводит к потере его трансфекционной активности (Balicki et al., 2002).
Liu и Soderhall использовали гистон Н2А для доставки двуцепочечной РНК (дцРНК) в клетки кроветворной ткани американского сигнального рака, Pacifastacus leniusculus. Эффективность трансфекции гистона Н2А была выше, чем у трансфекционного агента Effectene® и липосомных систем доставки нуклеиновых кислот. Важно отметить, что высокая эффективность гистона Н2А сочетается с низкой токсичностью и специфичностью для трансфицированных клеток, выделенных из кроветворной ткани Pacifastacus leniusculus (Liu et al., 2007).
Было показано, реконструированный хроматин в комплексе с гистонными белками Н2В, оптимизированными для ядерной доставки, может использоваться в качестве эффективного средства доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в ядро клеток млекопитающих (клеточная линия MCF7), в результате чего повышается уровень экспрессии трансгена (более чем в 6 раз больше по сравнению с трансфекционным реагентом Lipofectamine®) (Wagstaff et al., 2008).
Wagstaff с соавторами показали, что гистон Н2В эффективно доставляет ДНК посредством гистон-опосредованной трансдукции (англ. Histone-Mediated Transduction, НМТ) в различные клеточные линии. Эффективность трансфекции гистона Н2В в 2,5 раза выше, чем у коммерческих липосомных агентов. Эффективность трансфекции увеличивалась при использовании димера гистонов Н2А и Н2В, содержащего два домена белковой трансдукции (англ. protein transduction domains, PTD) (Wagstaff et al., 2007).
В работах Demirhan и Hasselmayer с соавторами (Demirhan et al., 1998; Hasselmayer et al., 2001) исследована эффективность комбинирования гистонофекции и липофекции для доставки генов в клетки, найдены оптимальные соотношения ДНК/липидов/гистонов. Авторы показали, что наибольшая эффективность генной трансфекции наблюдается с гистонами НЗ и Н4, однако в отличие от результатов, полученных Balicki и Beutler (Balicki et al., 1997),