Механизмы генерации и состав последовательностей внеклеточных ДНК в культуре клеток человека

• Автор: Морозкин, Евгений Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные физико-химические и биологические характеристики 9 внеклеточных нуклеиновых кислот
1.1. Общие физико-химические характеристики внеклеточной ДНК в 9 культурах клеток и организме человека

1.2 Внеклеточные нуклеиновые кислоты в составе молекулярных

комплексов и надмолекулярных структур

1.2.1. Внеклеточные нуклеиновые кислоты в комплексах с белками и 11 другими биополимерами

1.2.2. Внеклеточные РНК в составе экзосом

1.2.3. Нуклеиновые кислоты, связанные с поверхностью клеток

1.3. Механизмы появления внеклеточных нуклеиновых кислот
1.3.1 Активный транспорт нуклеиновых кислот во внеклеточную среду
1.3.2. Появление внеклеточных нуклеиновых кислот в результате
клеточной смерти
1.4. Представленность различных последовательностей в составе 30 внеклеточной ДНК
1.4.1. Современные методы сравнительного анализа ДНК
1.4.2. Исследование состава последовательностей внеклеточной ДНК
1.5. Биологические функции внеклеточных нуклеиновых кислот
1.5.1. Нуклеиновые кислоты в качестве сигнальных молекул
1.5.2. Участие внеклеточной ДНК в процессах горизонтального переноса 42 генов
1.5.3. Иммуностимулирующие свойства дезоксирибонуклеиновых кислот
1.5.4. Иммуностимулирующие свойства рибонуклеиновых кислот
Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Методы культивирования клеточных культур
2.2.1.1. Культивирование клеток цервикальной аденокарциномы (Нейа)

2.2.1.2. Получение и культивирование первичных эндотелиоцитов пупочной вены (HUVEC)
2.2.1.3. Получение и культивирование первичных фибробластов
2.2.2. Экспрессия тканеспецифических генов в культуре первичных эндотелиоцитов
2.2.3. Детекция микоплазмы в культуре клеток человека
2.2.4. Тест на жизнеспособность клеток
2.2.5. Измерение пролиферативной активности клеток
2.2.6. Анализ культуральной среды и трипсинового элгаата клеток с помощью ТЭМ
2.2.7. Обработка клеток ингибиторами классического и неклассического путей секреции белков
2.2.8. Исследование включения клетками биотинилированного производного dUTP
2.2.9. Мечение клеток Г!н| -тимидином
2.2.10. Подготовка образцов периферических лимфоцитов из крови человека
2.2.11. Выделение геномной ДНК из клеток человека
2.2.12. Выделение РНК из мембранно-цитозольной фракции эукариотических клеток на стекловолокнистых сорбентах
2.2.13. Получение фракций, содержащих свободные и связанные с клеточной поверхностью внеклеточные ДНК
2.2.14. Выделение ДНК из культуральной среды и трипсинового элюата
2.2.15. Выделение ДНК, содержащей биотин
2.3.16. Измерение концентрации ДНК с помощью флуоресцентного красителя Hoechst 33258
2.3.17. Условия проведения ПЦР и количественного TaqMan ПЦР
2.2.18. Введение радиоактивной метки в ДНК
2.2.19. Измерение концентрации ИЛ-6 в культуральной среде клеток
2.2.20. Получение ДНК-зондов при помощи метода LA-PCR
2.2.20.1. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.20.2. Получение ДНК с тупыми концами при помощи Pfu полимеразы
2.2.20.3. Лигирование адаптеров к ДНК по тупым концам
2.2.20.4. Лигирование адаптеров по липким концам ДНК
2.2.20.5. Амплификация продуктов реакции лигирования (LA-PCR)
2.2.20.6. Мечение ДНК-зондов мри помощи ПЦР
2.2.21. Условия проведения флуоресцентной гибридизации in situ
2.2.21.1. Приготовление цитологических препаратов метафазных хромосом лейкоцитов
2.2.21.2. Гибридизация ДЫК-зондов с метафазными хромосомами человека in situ
2.2.21.3. Выявление на цитологических препаратах флуоресцентно меченых ДНК-зондов
2.2.21.4. Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом
2.2.22. Клонирование и секвенирование ДНК-зондов, полученных после микродиссекции
2.2.22.1. Микродиссекция флуоресцентно меченых ДНК зондов
2.2.22.2. Приготовление компетентных клеток E
2.2.22.3. Клонирование ДНК
2.2.22.4. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК
2.2.22.5. Выделение плазмидной ДНК
2.2.22.6. Селекция колоний, содержащих вставку
2.2.22.7. Секвенирование и анализ клонов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Культуры клеток первичных эндотелиоцитов, первичных фибробластов и HeLa, как модели для изучения механизмов появления внеклеточной ДНК
3.2. Методы измерения концентрации внеклеточной ДНК
3.3. Получение фракций внеклеточной ДНК
3.4. Изменение концентрации внеклеточной ДНК в процессе культивирования клеток
3.5. Исследование состава комплексов внеклеточной ДНК при помощи трансмиссионной электронной микроскопии
3.6. Исследование стабильности эндогенной внеклеточной ДНК в культуральной среде
3.7. Исследование механизмов генерации внеклеточной ДНК
3.7.1. Исследование внеклеточного синтеза ДНК как источника внеклеточной ДНК
3.7.2. Влияние индукции апоптоза или стимуляции секреторной активности клеток на концентрацию ДНК в культуральной среде и на поверхности клеток
К недостаткам методов флуоресцентной гибридизации in situ можно отнести невысокую точность установления участка хромосомы, с которым происходит гибридизация анализируемой ДНК-иробы. То есть различие в локализации двух ДНК-проб может быть определено в том случае, если их разделяет как минимум 1 млн. пар нуклеотидов. Эффективность проведения сравнительной геномной гибридизации очень сильно зависит от качества цитологического препарата, а результаты CGII определяются качеством ДНК-проб, полученных из анализируемых образцов.
Следует отметить, что получение специфических ДНК-зондов для проведения FISII и анализ с ее помощью индивидуальных участков хромосом осложняются высоким содержанием в геномах эукариот повторяющихся последовательностей. Действительно, уникальные последовательности, эффективность амплификации которых меньше, чем эффективность амплификации повторенных последовательностей могут быть потеряны по ходу изготовления ДНК-зондов. В связи с этим одним из важных требований, предъявляемых к методам получения ДНК-библиотек, является высокое удельное содержание уникальных последовательностей в составе таких ДНК-библиотек. Однако, даже при условии равномерной полногеномной амплификации, в результате которой получается ДНК-библиотека, соответствующая исходной ДНК, полученная на ее основе ДНК-проба будет содержать значительное количество повторяющихся последовательностей. При проведении FISH такая ДНК-проба не будет удовлетворять требованиям специфичности, поскольку будет образовывать комплементарные комплексы с повторами, локализованными в разных участках хромосом. Получение специфического сигнала в соответствующем районе требует подавления гибридизации меченых фрагментов ДНК, содержащих повторенные ДНК-последовательности, при помощи предгибридизации с избытком Cot-1 ДНК [154].
1.4.2. Исследование состава последовательностей внеклеточной ДНК
Для того, чтобы получить данные об относительном составе внДНК были использованы как современные методы исследования представленности различных последовательностей в составе внДНК, так и традиционные методы, такие как клонирование с последующим секвенированием клонов и количественная ПЦР.
Ван дер Ваарт и коллеги исследовали состав последовательностей внДНК плазмы одного здорового донора и одного больного раком молочной железы [155]. Выделенная ДНК плазмы была клонирована и 65 клонов были секвенированы, из которых 35 соответствовали здоровому донору и 30 больному пациенту. Средняя длина клонированных последовательностей составила 200 п.п. В результате анализа полученных результатов с