Последовательности эндогенных ДНК, специфично связывающиеся с поверхностью эндотелиальных клеток

• Автор: Черноносова, Вера Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 134 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Дезоксирибонуклеиновые кислоты, связанные с поверхностью клеток ®

1.1.1. Общие свойства ДНК с клеточной поверхности

1.1.2. Взаимодействие ДНК с потенциальными мишенями на поверхности

клеток ^

1.2. Синтетические молекулы ДНК, формирующие комплексы с

клеточными белками

1.2.1. “ДНК-ловушки” - регуляторы экспрессии генов
1.2.2. ДНК-аптамеры, ингибирующие функции белков
1.2.3. ДНК-аптамеры к поверхностным маркерам эукариотических клеток
1.2.4. Особенности последовательностей ДНК, эффективно связывающихся с
эпитопами клеточной поверхности и проникающих в клетки
1.3. Эндотелиальные клетки — удобная модель для исследования
внеклеточных ДНК, связанных с поверхностью клеток
1.3.1. Общее строение эндогелиоцитов
1.3.2. Функции, рецепторы и секреторные белки эндотелиальных клеток
Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Олигонуклеотиды
2.3. Методы
2.3.1. Клегки и условия их культивирования
2.3.2. Электрофорез ДІ1К и ОДІ I
2.3.3. Выделение ДНК и ОДЫ из г еля при помощи электрозлюции
2.3.4. Получение трипсинового олюата с поверхности клеток
2.3.5. Активация сефарозы СЬ-4В бромцианом
2.3.6. Выделения ДНК из нуклеопротеиновых комплексов трипсинового элюата клеток
2.3.7. Получение и выделение [32Р] — меченых ОДН и фрагментов ДНК
2.3.8. Получение двуцепочечных адаптеров
2.3.9. Лигирование фланкирующих ОДН к 5'- и 3-' концам модельного ОДН
2.3.10. Лигирование фланкирующих ОДН к 3'- и 5'- концам [32Р] - меченых оцДНК

2.3.11. ПЦР-амплификация продуктов лигирования и выделение ПЦР-нродуктов из реакционной смеси
2.3.12. Наработка клеток E.coli штамм JM 109 для трансформации
2.3.13. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК
2.3.14. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli
2.3.15. Подготовка плазмиды pBlueScript И KS и ПЦР-продуктов для лигирования но липким концам
2.3.16. Лигирование ПЦР-продуктов в плазмиду pBlueScript 11 KS по липким концам
2.3.17. Получение супернатантов для определения распределения [32Р] -меченых олигонуклеотидов в клетках
2.3.18. Выделение ДНК и определение концентрации при помощи флуоресцентного метода
2.3.19. Выделение РНК из мембранио-цитозолыюй фракции эукариотических клеток на стекловолокннстых сорбентах
2.3.20. Экспрессия тканеспецифических генов в культуре эукариотических клеток
2.3.21. Подготовка слайдов для флуоресцентной микроскопии
2.3.22. Подготовка слайдов для хромосомного анализа эндотелиальных клеток
2.3.23. Подготовка образцов для исследования накопления олигонуклеотидов, модифицированных флуоресцеином, в клетках при помощи проточной цигометрии
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Введение
3.2. Культивирование и характеризация эндотелиальных клеток человека
3.3. Исследование кизко.молскулирных ДИК, связанных с поверхност ью эндотелноцитов
3.4. Разработка методологии выделения коротких ДНК, “прочно” связанных е поверхностью клеток
3.5. Разработка протокола лигирования фланкирующих ОДН к оцДНК в условиях низких концентраций оцДНК-мшненей
3.6. Выделение, амплификация, клонирование и секвенирование коротких ДНК с клеточной поверхности эндотелноцитов
3.7. Исследование связывания коротких олигонуклеотидов с эндотелиальными клетками
3.8. Компьютерный анализ геномной ДНК человека н выявление участков ДНК, содержащих кластеры отсеквеннрованных ДНК мотивов
3.9. Взаимодействие с эндотелиоцитами олигонуклеотидов, содержащих отсеквенированные ДНК мотивы
3.9.1. Исследование взаимодействия [32Р]-меченых олигонуклеотидов с эндотелиальными клетками

3.9.2. Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с клетками методами флуоресцентной микроскопии и прогонной цитофлюорометрии
Заключение
ВЫВОДЫ ИЗ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Рецептор-опосредованный эндоцптоз отличается от не специфического эндоцитоза тем, что связывание молекул с клеткой происходит через взаимодействие с рецепторами, расположенными в окаймлённых ямках/везикулах или кавеолах. Этот механизм характерен для транспорта липопротеинов, связывающих холесгерол; липопротеинов низкой плотности, инсулина, трансферрина и церулоплазмина [151].
Другим механизмом для транспорта молекул в эпдотелиоцитах является трансцитоз, в котором участвуют кавеолы [15, 152]. Как и эндоцитоз. трансцитоз можно условно поделить на рецептор-опосредованный и жидкофазный. Скорость транспорта молекул этим механизмом зависит от размера образовавшейся ямки в мембране, от концентрации молекул и их окружения. Жидкофазный трансцитоз был обнаружен для липопротеинов, связывающих холестерол, который вовлечен в метаболизм холестерина, как в мембране, так и в соседних клетках и прилегающих тканях. Рецептор-опосредованный трансцитоз является основным процессом, который характерен для большинства эпителиальных клеток, в том числе и для эндотелноцнтов. Примерами такого механизма являются транспорт трансферрина в микровезикулах головного и костного мозга или альбумина в тканях легкого, жировой ткани и эндотелии скелетной мышцы [157-158]. Изменения трансцитоза различных белков плазмы ассоциированы с такими заболеваниями, как диабет и гиперлипидемия [151].
Рецептор-опосредованные механизмы транспорта (эндоцптоз и трансцитоз) реализуются в эндотелиоцитах благодаря наличию на мембране клеток большого количества рецепторов для белков плазмы, таких как металлопротеазы (трансферрин, церулоплазмин), инсулин, липопротенны, альбумин [159-160].
Эндотелиальные клетки являются регуляторами тромбообразования [16] поскольку секретируют антигемофильнын антиген, названный фактором фон Виллебранда. Фактор у\Т синтезируется в эндотелиальных клетках как внутриклеточный протеин в форме пробелка е молекулярным весом 240 кЭа [125]. Перед секрецией из клеток, предшественник зрелого белка проходит стадии протеолитического расщепления, гликозилирования, карбоксилирования, сульфатирования. Эгог фактор является гликопротеином плазмы, образующим связь между эндотелиальными волокнами коллагена и рецептором тромбоцитов - гликопротеидом 1Ь/1Х. Фактор '\Ф выполняет две классические функции: е одной стороны, играет важную роль в адгезии тромбоцитов к поврежденным участкам кровеносных сосудов и способствует их агрегации; с другой стороны, является носителем антигемофнлического фактора 8. таким образом, косвенно участвуя в процессе свертывания крови [161].