Влияние аминокислотных замещений вблизи молекул бактериохлорофиллов PA и Bb на свойства реакционного центра Rhodobacter sphueroides

• Автор: Фуфина, Татьяна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список условных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Компоненты фотосинтетической мембраны

1.2. Фотосинтетические пигменты

1.2.1. Бактериохлорофиллы и хлорофиллы

1.2.2. Фикобилины

1.2.3. Каротиноиды

1.3. Особенности координирования атома магния (бактерио)хлорофиллов в фотосинтетических комплексах

1.4. Типы, состав и структура фотосинтетических реакционных центров

1.5 Перенос электрона в бактериальном реакционном центре
1.6 Исследование механизмов переноса электрона в бактериальных
реакционных центрах
1.6.1. Замещение кофакторов переноса электрона
1.6.2. Сайт - направленный мутагенез РЦ пурпурных бактерий
1.6.2.1. Использование методов молекулярной биологии для получения РЦ КЬа. зрЬаегoid.es, в которых отсутствуют кофакторы переноса электрона
1.6.2.2. Замещение кофакторов переноса электрона в РЦ КЬа.
sphaeroides при помощи методов генной инженерии
1.6.2.3. Мутации, которые приводят к изменению водородных связей вблизи кофакторов
1.6.2.4. Мутации, связанные с изменением ароматических
аминокислотных остатков
1.6.2.5. Изучение роли консервативных молекул воды в бактериальном РЦ
1.6.2.6. Мутации, способствующие переносу электрона по В-цепи

1.6.2.7. Мутации, приводящие к изменению симметрии РЦ
1.6.2.8. Создание химерных РЦ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.1.1. Используемые в работе бактериальные штаммы и плазмиды
2.1.2. Антибиотики, используемые в работе
2.1.3. Буферы и среды, используемые в работе
2.2. Микробиологические и молекулярно-биологические методы исследования
2.2.1. Выращивание бактериальных штаммов
2.2.2. Выделение тотальной ДНК Rba.sphaeroid.es
2.2.3. Выделение плазмидной ДНК
2.2.4. Полимеразная цепная реакция
2.2.5. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле
2.2.6. Препаративное выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы
2.2.7. Лигирование молекулы вектора и фрагмента
2.2.8. Электропорация
2.2.9. Перенос плазмид для комплементации из Е. соН в ЯЬа.
sphaeroides
2.3. Методы исследования реакционных центров
2.3.1. Выделение реакционных центров
2.3.2. Измерение спектров поглощения РЦ
2.3.3. Измерение дифференциальных (свет-минус-темнота) спектров
2.3.4. Определение пигментного состава
2.3.5. Измерение дифференциальных (свет-минус-темнота) ИК-ФТ
спектров
2.3.6. Измерение окислительно-восстановительного потенциала первичного донора электрона Р
2.3.7. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в
денатурирующих условиях
2.3.8. Обработка РЦ боргидридом натрия
2.3.9. Исследование стабильности РЦ
2.3.10. Обработка РЦ 1(Ы77)Н протеазами
2.3.11. Мягкая денатурация мутантных РЦ при помощи 8 М раствора
мочевины
2.3.12. Измерение спектров ЭПР
2.3.13. Фемтосекундная спектроскопия РЦ дикого типа и генетически
модифицированных РЦ 1(Ь177)Н и 1(Ы77)Н+Н(Ы73)Ь
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Внесение направленных аминокислотных замещений в РЦ КЬа.
8рЬаего1(1ез
3.1.1. Внесение направленного аминокислотного замещения 1(Ь 177)11 в РЦ7?6а. sphaeroides
3.1.2. Внесение направленных аминокислотных замещений
Н(Ы 73)Ь+1(Ь 177)Н в РЦ ЯЬа. зркаего{с1ез
3.1.3. Внесение направленных аминокислотных замещений
1(Ы77)Н+Н(М182)Ь в ¥\КЪа.$рИаего1с1е$
3.2. Особенности выделения и очистки РЦ с аминокислотными заменами 1(Ы77)Н; 1(Ы77)Н+Н(Ы73)Ь; 1(Ы77)Н+Н(М182)Ь
3.3. Спектры поглощения реакционных центров 1(Ы77)Н;
1(Ы77)Н+Н(1Л73)Ь; 1(Ь177)Н+Н(М182)Ь, измеренные при комнатной
температуре
3.4. Дифференциальные (свет минус темнота) спектры реакционных центров 1(Ы77)Н; 1(Ы77)Н+Н(Ь173)Ь; 1(Ь177)Н+Н(М182)Ь, измеренные при
комнатной температуре

значительное снижение скорости рекомбинации состояния P+Qa" (Williams, 1992).
Замещение Glu LI04 на Leu приводило к потере водородной связи с С-13'-кето группой циклопентанонового кольца БФео в РЦ Rba. capsulatus. Эта мутация привела к сдвигу полосы поглощения БФеод на 12 нм в Qx области спектра и несколько снизила скорость деактивации возбужденного состояния первичного донора электрона по сравнению с аналогичным показателем в РЦ дикого типа (Bylina, 1988).
1.6.2.4. Мутации, связанные с изменением ароматических аминокислотных остатков.
Исследование роли ароматических аминокислотных остатков в РЦ проводили путем замены Phe L181 и Туг М210. Эти аминокислотные остатки расположены симметрично друг другу, в непосредственной близости от димера, мономерных БХл и БФео обеих цепей. Была произведена замена одного аминокислотного остатка на другой. Замещение Tyr М210 на Phe приводило к снижению скорости переноса электрона к НА приблизительно в 5 раз по сравнению с аналогичным показателем в РЦ дикого типа. А замена Phe L181 на Туг привела к двукратному увеличению скорости дезактивации возбужденного состояния первичного донора электрона (Mattioli, 1991; Gray, 1990). Яковлев с соавторами показали наличие обратимого фемтосекундного переноса электрона от Р* к ВА, наблюдаемого в мутантных РЦ Y(M210)L и Y(M210)W при 1020 см"1, и отсутствие стабилизации состояния Р+ВА". Эти данные демонстрируют важную роль гидроксильной' группы тирозина М210 в процессе стабилизации состояния с разделенными зарядами. Возможная роль полярной ОН" группы тирозина может заключаться в ее переориентации в процессе формирования состояния Р'ВА" (Yakovlev, 2003).