Селекция ДНК-аптамеров к бактериям S. enteritidis и S. typhimurium, их свойства и применение

• Автор: Коловская, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

1. Обзор литературы

1.1. Аптамеры

1.2. Мишени аптамеров

1.3. Афинность и специфичность аптамеров

1.4. Конформации аптамеров

1.5. Библиотеки, использующиеся для селекции аптамеров

1.6. Технологии получения аптамеров

1.7. Модификации аптамеров

1.8. Анализ аптамеров

1.9. Использование аптамеров в качестве диагностических средств
1.10. Идентификация новых биомаркеров в результате клеточной селекции аптамеров
1.11. Использование аптамеров в качестве средств терапии
1.12. Использование аптамеров в качестве средств для создания антибиотиков нового поколения
1.13. Использование аптаемров в качестве средств для создания антибиотиков нового поколения
2. Материалы и методы исследований
2.1 Материалы и оборудование
2.2. Объекты селекции
2.3 Селекция аптамеров к клеточным стенкам сальмонелл с различной лекарственной устойчивостью
2.4 Исследование афинности и специфичности связывания аптамеров с разными видами сальмонелл
2.5. Клонирование аптамеров
2.6. Амплификация аптамеров
2.7. Осаждение ДНК-аптамеров и определение концентрации ДНК
2.8. Определение кажущихся констант диссоциации аптамеров к 5.
(уркшгиттг и 51. еЫегШсИя
2.9. Исследование антибактериального эффекта аптамеров к А (урМтипит и
5. еМегШсИз
2.10. Определение чувстительности сальмонелл к антибактериальным препаратам с помощью аптамеров
2.11. Генотипирование сальмонелл й1. еМегШсИй и 5. 1урЫтигтт
2.12. Статистические методы исследования

3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Селекция и определение аффинности и специфичности связывания полученных аптамеров к бактериям-мишеням
3.2. Клонирование и секвенирование пулов аптамеров
3.3. Определение кажущихся констант диссоциации аптамеров
3.4. Проверка антибактериального эффекта аптамеров к аптамеров к S. typhimurium и S. enteritidis
3.5. Определение чувствительности сальмонелл к антибактериальным препаратам с помощью аптамеров
3.6. Выявление S. enteritidis и S. typhimurium в клеточных суспензиях с
помощью аптамеров
Заключение
Выводы
Список цитируемой литературы
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
оцДНК - одноцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота
dNTP - дезокситрифосфаты
ИФА - иммуноферментный анализ
АТФ - аденозинтрифосфорная кислота
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
РИГА — реакция пассивной гемагглютинации
Kd - константа диссоциации
PBS - фосфатный буфер
SELEX — Системная Эволюция Лигандов Экспоненциальным Обогащением

патогенные для человека возбудители брюшного тифа, паратифов и сальмонеллеза. Множество серотипов сальмонелл связано с большой изменчивостью генов флагеллинов, обусловленной генетическими рекомбинациями, горизонтальным переносом генов, точечными мутациями, дупликациями и делециями, что увеличивает способность сальмонелл адаптироваться к иммунной системе человека. В основу классификации сальмонелл положены их метаболические особенности, согласно которым род Salmonella представлен двумя видами - S.enterica и S.bongori. Сальмонеллы вида S.enterica делятся на несколько подвидов. Деление на подвиды имеет эпидемиологическое значение. Сальмонеллы обладают тремя антигенными комплексами - О-соматическим (термостабильным), Н-жгутиковым (термолабильным) и поверхностным капсульным К-антигеном. Бактерии продуцируют экзотоксины, среди которых выделяют токсины, усиливающие секрецию жидкости и солей в просвет кишки, и цитокины, нарушающие синтез белка в клетках слизистой оболочки кишечника и воздействующие на клеточные мембраны. При разрушении сальмонелл выделяются эндотоксины, обуславливающие развитие интоксикации.
В настоящее время усиливается циркуляция полирезистентных штаммов сальмонелл (Козлова Н.С. и др., 2001; O'Brien T.F., 1997). Предполагается, что это связано с нерациональным использованием антибактериальных препаратов (самолечение, безрецептурная продажа антибиотиков) (O'Brien T.F., 1997). Исследование резистентных штаммов сальмонелл показало, что высокая устойчивость их к действию противомикробных средств обусловлена наличием у них R-плазмиды, получившей название R-фактора (O'Brien T.F., 1997).
Заболевания, вызванные полирезистентными штаммами сальмонелл, отличаются более длительным инкубационным периодом и более тяжелым течением заболевания. Основными патогенными факторами сальмонелл являются холероподобный энтеротоксин и эндотоксин липополисахаридной природы, микрокапсула, придающая микроорганизму устойчивость к