Рецептор фактора роста эндотелия сосудов второго типа : получение рекомбинантного препарата, моноклональных антител и системы направленного транспорта

• Автор: Корчагина, Анна Александровна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Значение VEGFR2 для неопластического ангиогенеза и антиангиогенной терапии

Введение

Структура рецепторов семейства VEGFR

Биологические функции VEGFR

VEGFR2 и его биологическая роль

Опухолевый апгиогенез

Ингибиторы VEGFR рецепторов в антиангиогенной терапии опухолей

Функциональное значение растворимых форм рецепторов

Резистентность опухолей к антиангиогенной терапии
Направленная доставка наноконтейнеров
Перспективы и заключение
ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Полимеразная цепная реакция
Молекулярное клонирование
Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК
Анализ клонов
Подбор условий индукции экспрессии белка
Культивирование клеток E.coli для препаративной наработки белка
Выделение и очистка рекомбинантного белка
Аффинная хроматография на Ni2+-NTA агарозе
Денатурирующий электрофорез белков в ДСН-ПААГ
Иммуноблот анализ
Измерение концентрации белка
Биотинилирование белка
Метод лиганд-рецепторного анализа
Культуры клеток
Скрининг гибридом
Аффинная хроматография на протеин А-сефарозе
Константа аффинности антител
Определение класса иммуноглобулинов
Конкурентное взаимодействие
Тест восстановления мопослоя
Синтез наногелей, конъюгация с векторными группами
Анализ накопления наногелей in vitro
Анализ накопления и распределения наногелей в глиоме in vivo
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ
Клонирование гена кодирующего экстраклеточный домена VEGFR2 в экспрессирующие векторы
Анализ экспрессии VEGFR2i.hi рецептора в различных конструкциях
Металлохелатная хроматография на Ni2+-NTA агарозе
Получение и ммунохимический анализ моноклональных антител
Исследование специфичности моноклональных антител
Конкурентное связывание моноклональных антител к VEGFR
Иммунофлюорссцентный анализ моноклональных антител
Лиганд-рецепторный анализ взаимодействия рекомбинантного экстраклеточного фрагмента VEGFR2 с VEGF
Исследование биологической активности полученных моноклональных антител на клетках культуры С6 глиомы в экспериментах in vitro
Накопление векторных наногелей в клетках С6 глиомы in vitro
Накопление векторных наногелей в опухоли in vivo
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ:
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Akt/PKB - протеин киназа В Ang - ангиопоэтин
bFGF - основной фактор роста фибробластов DAG - диацилглицерол
DAPI - флуоресцентный ядерный краситель 4',6-диамидино-2-фенилиндол Dil - флуоресцентный липофильный краситель (549/565)
EGF - эпидермальный фактор роста
EGFR - Рецептор эпидермального фактора роста
Erk - Extracellular signal-regulated kinases
FAK - киназа фокальной адгезии
FDA - food and drug administration
FGF - фактор роста фибробластов
GBM - мультиформная глиобластома
GFAP - глиофибриллярный кислый протеин
НЕК293 - линия человеческой эмбриональной почки
HGG - глиомы III-IV степени злокачественности

H1F1 а-транскрипционный фактор индуцируемый гипоксией 1-альфа
FIUVEC-линия человеческих эндотелиоцитов из пупочной вены
IgG - неспецифические иммуноглобулины
IL - интерлейкин
IP3 - инозитол трифосфат
IRE-let - inositol-requiring enzyme 1-alpha
MAP2K/MEP - Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase
МАРК - Mitogen-activated protein kinases
MMP - матриксные металлопротеиназы
Nrp - нейропилин
OD - оптическая плотность
p53 - белок
PFS6 - выживаемость без прогрессии в течение 6 месяцев Р13К - фосфоинозитол 3-киназа PIP2 - фосфоинозитол 4,5-бифосфат

стромального компартмента при ангиогенезе. В этом процессе участвуют опухоль-ассоциированные фибробласты, которые играют важную роль при росте опухоли и развитии резистентности к анти-VEGF терапии, синтезируя PDGF-C [169].
Другим вероятным механизмом устойчивости опухолей к терапии является клеточная аутофагия — это эволюционно консервативный процесс лизосомальной внутриклеточной деградации клеточных компонентов, начиная от макромолекул и заканчивая органеллами. Аутофагия играет важную роль в жизнедеятельности клеток, ее роль заключается в деградации поврежденных органелл, внутриклеточных патогенов и избыточных частей цитоплазмы, а также долгоживущих, аномальных или агрегированных белков, которые могут привести к повреждению и гибели клетки. Есть данные, что гипоксия, вызванная антиангиогенной терапией, может запускать аутофагию через HIF 1а, АМРК и BNIP3. Такая аутофагия является клеточным адаптивным механизмом. Последние эксперименты показали, что в условиях гипоксии и при недостатке питательных веществ аутофагия способствует выживанию клеток. В то время как ее ингибирование в клетках с высоким уровнем гипоксии приводит к апоптотической клеточной гибели in vitro. Например, в регионах гипоксии глиобластомы, устойчивой к терапии бевацизумабом, повышался уровень экспрессии медиатора аутофагии BNIP3. Кроме того, комплексная терапия бевацизумабом и ингибитором аутофагии хлорокином (chloroquine) повышает количество апоптотических клеток в опухоли [169]. Эти результаты свидетельствует о вовлеченности гипоксия-индуцированной аутофагии в резистентность клеток глиомы к антиангиогенной терапии. Таким образом, аутофагия может рассматриваться, как один из процессов развития резистентности опухолевыми клетками, и ингибиторы аутофагии могут быть использованы для повышения эффективности противоопухолевой терапии.
Следует помнить, что значение аутофагии и ее роль в клеточной регуляции более сложная. Аутофагия может способствавать выживанию клеток, но может запускать и аутофагия-зависимую программируемую клеточную гибель [169]. Например, темозоломид, гамма-излучение и гипертермия индуцирует аутофагийную клеточную гибель глиомных клеток [170]. Кроме того, показано что рапомуцин, ингибитор mTOR, активирует автофагию и ингибирует пролиферацию глиомных клеток [171].
Таким образом, аутофагия в зависимости от условий может выполнять супрессорную или, наоборот, защитную функцию. В нормальных условиях аутофагия ограничивает рост клеток и может индуцировать их гибель, тогда как в случае малигнизации ингибирование аутофагии запускает рост опухоли. В тоже время, в