Неорганические полифосфаты при нарушениях функционирования протонных АТФаз у Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Томашевский, Александр Андреевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Оглавление

Введение

Часть 1. Обзор литературы

Глава 1. Метаболизм и функции полифосфатов у низших эукариот.

1.1. Полифосфаты у дрожжей .

1.1.1. Ферменты метаболизма полифосфатов у дрожжей.

1.1.2 Полифосфаты как фосфорный резерв у дрожжей.

1.1.3. Роль полифосфатов в формировании и функционировании клеточной оболочки

1.1.4. Полифосфаты и биоэнергетические процессы в клетках дрожжей.

1.1.5. Роль полифосфатов в накоплении и детоксикации катионов

1.1.6. Влияние различных мутаций на полифосфаты у дрожжей.
1.2. Особенности метаболизма и функций неорганических полифосфатов у мицелиальных грибов.
1.3. Полифосфаты у слизевиков.
1.4. Полифосфаты у простейших.
1.5. Полифосфаты у водорослей.
Глава 2. Полифосфаты у животных и перспективы их изучения и использования в медицине.
2.1. Полифосфаты и апоптоз у животных.
2.2. Полифосфаты и мембранный транспорт у животных.
2.3. Влияние полифосфатов на активность ферментов у животных.
2.4. Полифосфаты в костной ткани.
2.5. Полифосфаты в крови.
Часть 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Объекты исследования.
2.2. Состав среды и условия культивирования.
2.3. Условия гиперкомпенсации.
2.4. Получение сферопластов из дрожжевых клеток.
2.5. Выделение митохондрий.
2.6. Фракционирование клеток дрожжей.
2.7. Выделение вакуолей.
2.8. Определение ферментативных активностей .
2.9. Определение активности АТФазы плазматической мембраны т яИи.
2.10. Экстракция неорганических полифосфатов.
2.11. Осаждение неорганических полифосфатов в виде нерастворимых солей бария.
2.12. Электрофорез неорганических полифосфатов в ПААГ.
2.13. Определение ортофосфата.
2.13. Определение белка.
2.14. Определение образования ДрН на мембране изолированных вакуолей.
Часть 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Неорганические полифосфаты у дрожжей при мутациях, нарушающих функционирование АТФсинтетазы митохондрий
3.1.1. Влияние мутаций в гене АТР22 на содержание полифосфатов различных фракций у 5. cerevisiae
3.1.2. Влияние мутаций в гене АТР22 на длину цепи полифосфатов
3.1.3. Полифосфаты и ферментативные активности в изолированных митохондриях.
3.2. Полифосфаты у дрожжей с нарушением функционирования АТФазы плазматической мембраны.
3.2.1. Содержание Полифосфатов у дрожжей с нарушением функционирования АТФазы плазматической мембраны.
3.2.2. Влияние мутации в гене РМА1 на длину цепи полифосфатов.
3.3. Полифосфаты у дрожжей с нарушением функционирования вакуолярной АТФазы.
3.3.1. Особенности штамма Б. сегег1я1ае с делецией в гене УМА2.
3.3.2. Снижение содержания полифосфатов у дрожжей с нарушением функционирования вакуолярной АТФазы.
3.3.3. Влияние мутации в гене УМА2 на длину цепи полифосфатов.
3.3.4. Полифосфаты у дрожжей с нарушением функционирования-вакуолярной АТФазы в условиях фосфорного голодания и гиперкомпенсации полифосфатов.

3.3.5. Влияние ВССР на содержание полифосфаты у дрожжей с нарушением функционирования вакуолярной АТФазы.
3.3.6. Фракционирование дрожжевых клеток и оценка локализации полифосфатов. 87 Заключение
Выводы
Список литературы

внесли работы Miyachi и сотрудников [Miyachi et al., 1964], которые показали, что только одна из четырех фракций полиР у Chlorella формируется на свету. В целом, полученные данные не исключают возможности как прямого синтеза полиР с использованием энергии трансмембранных градиентов ионов на свету, так и синтеза полиР за счет АТФ в темноте, причем у разных видов водорослей, в зависимости от освещенности и других условий, могут преобладать те или иные процессы [Кулаев и др., 2005]. Эти вопросы требуют дальнейших исследований, так как ферментные системы, ответственные за синтез полиР у водорослей, остаются неизученными.
Ряд работ свидетельствует в пользу того, что водоросли могут использовать иолиР для выживания в условиях стресса. А именно при защелачивании цитоплазмы, вызванном избытком ионов аммония [Pick et al., 1990; Bental et al., 1990; Pick and Wess, 1991], высокой внеклеточной концентрации нитрата [Lundberg et al., 1989], при гиперосмотическом и гипоосмотическом стрессе [Leitao et al., 1995].
О ферментах метаболизма полиР у водорослей имеются лишь фрагментарные сведения. У Acetabularia найдена активность, переносящая фосфатный остаток с полиР на АДФ, и также экзополифосфатазная активность [Рубцов и Кулаев, 1977]. В хлоропластах Chlamydomonas reinhardtii присутствует гуанозин- 3',5'-бипирофосфат (ppGpp) синтетаза-гидролаза [Kasai et al, 2002]. Ген этого белка сходен по последовательности с соответствующими бактериальными генами семейства relA-spoT, вследствие чего авторы предположили возможность сохранения в хлоропластах этой водоросли бактериального «stringent»-0TBeTa, опосредованного (p)ppGpp [Kasai et al, 2002].
Что касается высших растений, присутствие полиР было впервые достоверно доказано в корнях кукурузы [Вагабов и Кулаев, 1964], а затем эти соединения были обнаружены у многих видов растений в стеблях, листьях и других органах [Кулаев, 1975]. Значителхлое количество инозитолфосфатов, накапливаемое у растений [Соболев, 1962], осложняет идентификацию и анализ полиР. Наличие ферментативных активностей, метаболизирующих полиР, было отмечено у ряда растений [Jungnickel, 1973], однако