Апоптоз раковых клеток человека, индуцируемый рекомбинантным аналогом лактаптина

• Автор: Фомин, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 133 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 МЕХАНИЗМЫ ИНДУКЦИИ И РАЗВИТИЯ АПОПТОЗА И ПРОАПОПТОТИЧЕСКИЕ БЕЛКОВЫЕ ФАКТОРЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Введение

1.2 Рецептор-опосредованный путь апоптотической гибели клетки

1.2.1 Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли

1.2.2 Структурная организация рецепторов смерти

1.2.3 Механизм сигнальной активации рецепторов смерти

1.2.4 Индукция апоптотической гибели клетки через активацию рецептора TNFR1

1.2.5 Индукция апоптотической гибели клетки через активацию рецептора CD95

1.2.6 Участие интегриновых рецепторов в индукции апоптотической гибели клетки
1.3 Эндогенный путь апоптоза
1.3.1 Внутриклеточные механизмы индукции апоптоза
1.3.2 Факторы, регулирующие проницаемость мембраны митохондрий
1.3.3 Митохондриальный путь индукции апоптотической гибели клетки
1.4 Регуляторы и индукторы апоптоза
1.4.1 Каспазы и их классификация
1.4.2 Клеточные субстраты эффекторных каспаз
1.4.3 Роль белка р53 в апоптозе
1.5 Белковые факторы - индукторы апоптотической гибели опухолевых клеток
1.5.1 Проапоптотическис цитокины TNF-cc, FasL и TRAIL
1.5.2 Моноклональные антитела, индуцирующие апоптоз
1.5.3 Интерфероны
1.5.4 Интерлейкин-24 (IL-24/mda-7)
1.5.5 Вирусные белки, индуцирующие апоптоз раковых клеток
1.5.6 Рибонуклеазы, индуцирующие апоптоз раковых клеток
1.5.7. Кротамин
1.5.8 Белки и пептиды молока, индуцирующие апоптоз раковых клеток
1.6 Заключение
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы и реактивы
2.2 Антитела, ферменты и субстраты
2.3 Дсзоксирибонуклеотиды

2.4 Буферные растворы
2.5 Методы
2.5.1 Получение продуцентов рекомбинантных аналогов лактаптина
2.5.2 Выделение рекомбинантных аналогов лактаптина RL1 и RL2 из лизатов клеток E.coli
2.5.3 Очистка рекомбинантного аналога лактаптина RL2
2.5.4 Обращенно-фазовая ВЭЖХ рекомбинантного аналога лактаптина RL2
2.5.5 Культуры клеток
2.5.6 Определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста
2.5.7 Анализ экспозиции фосфатидилсерина на поверхности цитоплазматической мембраны клеток MCF
2.5.8 Анализ изменений трансмембранного потенциала митохондрий клеток MCF
2.5.9 Анализ активации каспаз методом проточной цитофлуориметрии
2.5.10 Получение КЬ2-сефарозы
2.5.11 Синтез родаминового конъюгата рекомбинантного аналога лактаптина RL2
2.5.12 Флуоресцентная микроскопия клеток MCF-7 и MSC
2.5.13 Иммуноферментный анализ проникновения RL2 в клетки MCF
2.5.14 Иммуноферментный анализ рекомбинантного аналога лактаптина RL2
2.5.15 Определение концентрации белка методом Бредфорда
2.5.16 Афинная хроматография лизатов клеток MCF-7 на 11Ь2-ссфарозе
2.5.17 Трипсннолиз белков в ПААГ
2.5.18 Масс-спектрометрический анализ фрагментов трипсннолитического гидролиза белков
2.5.19 Анализ масс-спектров пептидов с использованеисм базы данных Swiss-Prot
2.5.20 Электрофоретический анализ ДНК клеток MCF
2.5.21 Анализ белковых препаратов электрофорезом в ПААГ в присутствии SDS
2.5.22 Вестерн-блотт анализ белков и лизатов клеток
2.5.23 Анализ содержания липополисахаридов в препаратах RL2
2.5.24 Подготовка препаратов суммарной клеточной РНК клеток MCF-7 для
гибридизации на чипе НТ-12 (Illumina)
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Введение
3.1.1 Конструирование рекомбинантных аналогов лактаптина
3.1.2 Выделение и характеризация рекомбинантных аналогов лактаптина

3.2 Анализ цитотоксического действия генно-инженерных аналогов лактаптина на
клетки человека в культуре
3.2.1 Сравнительный анализ цитотоксического действия RL1 и RL2 на клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF
3.2.2 Анализ цитотоксического действия RL2 на клетки человека различного тканевого происхождения
3.3 Получение инъекционной формы рекомбинантного аналога лактаптина RL2
3.4 Анализ цитотоксического действия инъекционого препарата RL2 на клетках MCF-7,
MDA-MB-231 и MSC в культуре
3.5 Механизм цитотоксического действия RL2 на клетки MCF
3.5.1 Анализ транслокации фосфатидилсерина на внешнюю поверхность плазматической мембраны клеток MCF
3.5.2 Анализ изменения трансмембранного потенциала митохондрий клеток MCF-7 под действием RL2
3.5.3 Анализ активации инициаторных каспаз в клетках MCF-7 под действием RL2
3.5.4 Анализ активации эффекторных каспаз, ДНКазы DFF40 и олигонуклеосомной фрагментации ДНК клеток MCF-7 под действием RL2
3.6 Анализ проникновения и локализации RL2 в клетках человека
3.7 Выделение и идентификация белков, взаимодействующих с RL2
3.8 Анализ изменений транскриптома клеток MCF-7 под действием RL2 методом
гибридизации РНК на чипах Illumina
3.8.1 Первичный анализ результатов гибридизации РНК на чипе НТ-12 (Illumina)
3.8.2 Изменение экспрессии индивидуальных генов клеток MCF-7 под действием RL2
3.8.3 Функциональный анализ изменения экспрессии генов клеток MCF-7 под действием RL2
3.9 Модель механизма апоптотической гибели клеток MCF-7, индуцируемой RL2
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

катепсинами [78, 80], и его выходу в цитоплазму клетки. При проникновении в ядро клетки АШ связывается с ДНК и участвует в ее фрагментации. Механизм участия АІЕ во фрагментации ДНК в настоящее время однозначно не установлен [78].
1.4 Регуляторы и индукторы апоптоза
1.4.1 Каспазы и их классификация
В 1992 г. одновременно две группы исследователей заявили об обнаружении протеазы человека, ответственной за активацию предшественника интерлейкина-1 р -сокращенно ICE. Несколько месяцев спустя было обнаружено сходство структуры ICE с продуктом гена ced3, который, как было показано, реализует апоптотическую гибель клеток Caenorhabditis elegans. Эти публикации инициировали дальнейшие исследования гомологов ICE, которые могли бы быть ответственны за клеточную гибель в клетках млекопитающих [81].
В настоящее время известно более десяти структурных и функциональных гомологов первоначально обнаруженной протеазы ICE [82]. Все эти ферменты были названы каспазами (caspases: cysteinyl aspartate-specific proteases) и являются
высокоспецифичными цистеиновыми протеазами, общей особенностью которых является расщепление пептидной связи субстрата после остатка аспарагиновой аминокислоты. Каспазы синтезируются в цитоплазме клетки в форме неактивных предшественников -прокаспаз, структура полипептидной цепи которых содержит продомен, большую р20 и малую р 10 субъединицы. Активная форма каспазы представляет собой гетеротетрамерный комплекс р202-р102, состоящий из двух больших и двух малых субъединиц. В соответствие со структурой и функцией продомена, каспазы разделяют на три основные группы [81, 83] (Рис. 7).
р20 р10
III! I mill "'"-jDISiii...Dtoi| ЬСООН каспаэа 1/4/5 ]l группа
NHf- CARDl
ШИ Г5кр> fl DtS;»7p,S,7,.„p,L»m
1111. "|g" W|P" ——П1С-~ tt"4—| | , || каспаэа 3/6/7 }lll группа
Рис. 7. Схема строения трех классификационных групп каспаз; стрелками указаны сайты расщепления прокаспазы-1, -3, -8 и
II группа