Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому C6

• Автор: Шеин, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Актуальность

Глава I. Обзор литературы: Фактор роста эндотелия сосудов как мишень противоопухолевой терапии
Введение

Функции VEGF

Роль VEGF в развитии опухолей

Бевацизумаб в клинических исследованиях

Механизмы резистентности

Опухолевые стволовые клетки

Иммунолипосомы для адресной доставки лекарств

Глава II. Материалы и методы
Животные
Клеточные линии
Иммунизация животных
Процедура слияния
Подготовка фидерного слоя
Клонирование гибридом
Криоконсервация
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)
Иммуноцитохимический анализ
Иммуногистохимический анализ
Диск-электрофорез белков в ДДС-ПААГ
Иммуноблотинг
Определение класса иммуноглобулинов
Константа аффинности
Наработка асцитов
Очистка моноклональных антител методом аффинной хроматографии
Очистка антител методом иммуноаффинной хроматографии
Измерение концентрации белка
Wound-healing тест
Конъюгация антител с флуорохромом

Моделирование интракраниальной глиомы
Внутривенное введение
Антиангиогенная терапия
Конъюгация магнитных наночастиц с моноклональными антителами
МРТ визуализация векторных наночастиц
Синтез ПЭГилированных липосом
Конъюгация анти-VEGF антител с липосомами
Г ель-фильтрационная хроматография
Захват и накопление иммунолипосом in vitro
Накопление и захват векторных липосом in vivo
Глава III. Результаты и обсуждения
Скрининг и селекция гибридом
Иммуноблотинг
Константа аффинности антител
Иммуноцитохимический анализ
Иммуногистохимический анализ глиомы С6 крысы
Исследование биологической активности антител in vitro
Оценка накопления меченных антител в опухоли in vivo
Антиангиогенная терапия
Векторные наночастицы для МРТ визуализации
Накопление липосом in vitro
Накопление векторных липосом в опухоли in vivo
Выводы
Список литературы

Список сокращений
Akt/PKB - протеин киназа В Ang - аш иопоэтин
bFGF - основной фактор роста фибробластов С6 - линия крысиной глиомы С6 Сх-43 - коннексин
CXCR4 - С-Х-С хемокиновый рецептор 4 типа DAG - диацилглицерол
DAPI - флуоресцентный ядерный краситель 4',6-диамидино-2-фенилиндол DDAB - димстилдиоктодециламоний бромид
Dil - флуоресцентный краситель 1,1’-октадецил 3,3,3’,3-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат
DSPE - 1,2-дистеароил-зп-глицеро-3-фосфоэтаноламин аммониевая соль
EGF - эпидермальный фактор роста
EGFR - Рецептор эпидермального фактора роста
ELISA - твердофазный иммупоферментный анализ
Erk - Extracellular signal-regulated kinases
FAK - киназа фокальной адгезии
FDA - food and drug administration
FGF - фактор роста фибробластов
GBM - мультиформная глиобластома
GFAP - глиофибриллярный кислый протеин
HAT - гипоксантин, аминоптерин, тимидин
НЕК293 - линия человеческой эмбриональной почки
HGG - глиомы III-IV степени злокачественности
HIFla-транскрипционный фактор индуцируемый гипоксией 1-альфа
НТ - гипоксантин, тимидин
HUVEC — линия человеческих эндотелиоцитов из пупочной вены
IGF - инсулинподобный фактор роста
IgG — неспецифические иммуноглобулины
IL - интерлейкин
IP3 - инозитол трифосфат
IRE-la - inositol-requiring enzyme 1-alpha
лекулярных мишеней: ингибирование альтернативных проангиогенных факторов и их рецепторов, совместно с антшшвазивными препаратами, препятствующими локальной миграции и метастатическому распространению. Перспективным направлением может стать комбинирование бевацизумаба с препаратами, направленными на подавление эффектов HIFla и PI3K/Akt сигнального пути, или гликолитического метаболизма. Подобные муль-ти-молекулярные подходы, направленные на резистентные, мигрирующие глиомные клетки и стволовые опухолевые клетки, станут новым этапом в управлении и сдерживании агрессивных новообразований.
Опухолевые стволовые клетки
Существует гипотеза, что антиангиогенная терапия может индуцировать пролиферацию и инвазию стволовых опухолевых клеток, что нередко приводит к формированию инвазивного фенотипа роста опухоли и поглощению кровеносных сосудов. После получения первых результатов антиангиогенной терапии злокачественных глиом возникли вопросы о влиянии терапии на инвазивную популяцию опухолевых клеток. Существуют данные о присутствии недифференцированных предшественников нервных клеток в опухолях мозга [89,90,181,182]. Были выделены и идентифицированы клетки GBM человека, обладающие потенциалом нейрональных стволовых клеток, включая мультипотентность ex vivo и способные образовывать GBM-подобные опухоли после интракраниальной ксе-нотрансплантации животным [91]. В другой работе из периваскулярного пространства глиомы человека были выделены CD133+ позитивные опухолевые стволовые клетки ко-экспрессирующие хемокиновый рецептор CXCR4 [106]. Интересно, что стимуляция CD133+ позитивных опухолевых стволовых клеток лигандом SDFla индуцирует их миграцию и экспрессию VEGF через активацию PI3K/Akt сигнального пути. Ингибирование рецептора CXCR4 микро-РНК или плериксафором (мозобил) снижало экспрессию VEGF in vitro, а также замедляло рост опухоли и ангиогенез in vivo. Эти результаты демонстрируют важное значение хемотаксиса [180], а точнее SDFla и его рецептора CXCR4, в индуцированном глиомными стволовыми клетками росте опухоли, в VEGF-опосредованном ангиогенезе и метастатическом распространении [196].
Показано, что высоко инвазивные опухоли мозга GBM человека могут развиваться после трансплантации стволовых опухолевых клеток иммунодефицитным крысам [92]. Эти опухоли проявляют агрессивный инвазивный рост в отсутствие ангиогенеза, опухолевые клетки при этом экспрессируют некоторые маркеры нервных прогениторных клеток и мигрируют подобно нормальным нервным клеткам. Последовательный пассаж ксе-нотрансплантатов через животных постепенно приводил к преобразованию опухоли в бо-