Механизм защитного действия ганглиозидов на клетки РС12 при окислительном стрессе

• Автор: Власова, Юлия Александровна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: [Санкт-Петербург]
• Количество страниц: 157 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

РАЗДЕЛ 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

РАЗДЕЛ 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие представления о строении, составе и локализации ганглиозидов

в организме животных и человека

2.1.1. Классификация ганглиозидов. Структура ганглиозидов, характерных для нервной ткани
2.1.2. Содержание ганглиозидов в ткани мозга и некоторых других органов млекопитающих

2.1.3. Роль ганглиозидов в организации клеточной мембраны

2.1.4. Изменение ганглиозидов мозга позвоночных в процессе эволюции

2.2. Обмен ганглиозидов
2.2.1. Анаболизм ганглиозидов
2.2.2. Нарушения синтеза ганглиозидов
2.2.3. Катаболизм ганглиозидов
2.2.4. Нарушения катаболизма ганглиозидов
2.3. Нейропротекторная активность ганглиозидов
2.3.1. Защитный эффект введения ганглиозидов животным in vivo
2.3.2. Повышение жизнеспособности нервных клеток под влиянием ганглиозидов в опытах in vitro
2.4. Клинические испытания ганглиозидов
2.5. Влияние ганглиозидов на обучение, формирование памяти, процессы межклеточного взаимодействия. Рецепторная роль ганглиозидов
2.5.1. Влияние ганглиозидов на обучение, формирование памяти
2.5.2. Участие ганглиозидов в нейритогенезе
2.5.3. Ганглиозиды в процессах межклеточного взаимодействия, рецепторная роль ганглиозидов
2.6. Роль модуляции сигнальных систем в механизме защитного действия ганглиозидов

2.7. Антиоксидантные эффекты ганглиозидов
2.7.1. Окислительный стресс и его роль в поражении нервных клеток
2.7.2. Антиоксидантные функции ганглиозидов
2.8. Регуляция апоптоза и некроза сигнальными системами
РАЗДЕЛ 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Условия культивирования клеточной линии РС
3.2. Методы определения жизнеспособности клеток РС
3.2.1. Определение жизнеспособности клеток PC 12 по выходу лактатдегидрогеназы из разрушенных клеток
3.2.2. Определение жизнеспособности клеток по превращению МТТ в окрашенный МТТ-формазан
3.3. Определение активности регулируемой внеклеточными сигналами киназы 1/2 (ERK1/2) и протенкиназы В (Akt) в клетках РС12 в контрольных клетках, при действии перекиси водорода и ганглиозида методом иммуноблоттинга
3.4. Иммунопреципитация TrkA-рецепторов
3.5. Определение аккумуляции активных форм кислорода в клетках РС12.
3.5.1. Определение аккумуляции активных форм кислорода в клетках PC 12 при действии перекиси водорода и ганглиозида GM
3.5.2. Определение аккумуляции активных форм кислорода в клетках PC 12 при действии бактериального p-липополисахарида и ганглиозидов GDI а и GM
3.6. Метод определение активности Na+,K+-ATФазы в клетках РС12 при действии перекиси водорода и ганглиозида GM
3.7. Выделение индивидуальных ганглиозидов из мозга млекопитающих
3.8. Анализ и статистическая обработка данных
РАЗДЕЛ 4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Влияние ганглиозида GM1 и других основных ганглиозидов мозга на жизнеспособность клеток РС12 в условиях окислительного стресса
4.1.1. Основные ганглиозиды мозга (GM1, GDI a, GDlb и GTlb) увеличивают жизнеспособность клеток РС12, подвергнутых действию перекиси водорода
4.1.2. Влияние разных способов снятия клеток PC 12 с поверхности фласков и времени инкубации клеток с ганглиозидом GM1 на его защитный эффект

ганглиозида GM1 в условиях окислительного стресса
4.1.3. Защитный эффект ганглиозида GM1 на клетки РС12 в условиях окислительного стресса зависит от его концентрации
4.1.4. Ингибитор тирозинкиназы Trk-рецепторов блокирует защитное действие
ганглиозида GM1 на клетки PC 12, подвергнутые действию перекиси водорода
4.1.5. Ингибиторы РКС, PI3K, МЕК 1/2 снижают защитное действие ганглиозида GM1 на клетки РС12, подвергнутые действию перекиси
водорода
4.2. Влияние ганглиозида GM1 на экспрессию и активность тирозинкиназы Trk-рецепторов, ERK1/2 и Akt в клетках РС12 в контроле и в условиях окислительного стресса
4.2.1. Влияние GM1 и перекиси водорода на экспрессию и активность TrkA (уровень pTyr TrkA) в клетках РС
4.2.2. Влияние GM1 и перекиси водорода на экспрессию и активность Akt (уровень pAkt) в клетках РС
4.2.3. Влияние GM1 и перекиси водорода на экспрессию и активность ERK1/2 (уровень pERKl/2) в клетках РС
4.3. Метаболические эффекты ганглиозида GM1 на клетки РС12, подвергнутые действию токсических концентраций перекиси водорода
4.3.1. Ганглиозид GM1 снижает накопление активных форм кислорода в клетках РС12, индуцированное перекисью водорода
4.3.1.1. Ингибитор тирозинкиназы Trk-рецепторов блокирует антиоксидантное действие ганглиозида GM
4.3.1.2. Влияние ингибиторов РБК, МЕК1/2 и РКС на способность ганглиозида GM1 снижать аккумуляцию активных форм кислорода в клетках PC 12, индуцированную перекисью водорода
4.3.1.3. Ганглиозид GM1 в наномолярных концентрациях снижает накопление активных форм кислорода в клетках PC 12 в условиях окислительного стресса
4.3.2. Ганглиозид GM1 снижает окислительную инактивацию Ыа+,К+-АТФазы в клетках РС12, индуцированную перекисью водорода, ингибитор тирозинкиназы Trk-рецепторов
блокирует этот эффект ганглиозида GM
4.4. Защитный и антиоксидантный эффект ганглиозидов при действии на клетки РС12 бактериального липополнсахарида

2.5.2. Участие ганглиозидов в нейритогенезе
Ганглиозиды обладают нейритогенным эффектом. В этом отношении их эффект сходен с эффектом NGF [Huang et al., 2007]. Показано, что при добавлении к культуре клеток ганглиозид GM1 может усиливать нейритогенез и в отсутствии NGF. Имеются свидетельства того, что GM1 стимулирует нейрогенез путем модуляции входа Са2+ в клетку [Fang et al., 2000]. Изменения тока Са2+ рассматривается как важнейший сигнальный механизм для роста аксонов [Fang et ah', 2000]. Ганглиозиды GM1 и GTlb усиливают действие NGF культуре клеток PC 12. Число отростков увеличивается в присутствии NGF и одного из ганглиозидов по сравнению с теми культурами, где присутствовал только NGF [Ferrari et al., 1995]. Ганглиозид GQlb в наномолярных концентрациях способен имитировать активность, характерную для NGF в культуре нейробластомы человека GOTO и NB-i [Tsuji et al., 1988].
Способность ганглиозида GM1 усиливать нейритогенез, очевидно, определяется и связыванием ганглиозида GM1 с ламинином-1, что приводит к усилению роста аксонов у клеток линий РС12 и DRG. Образование связи GM1-ламинин-1 вызывает агрегацию ганглиозида в составе рафтов и способствует последующей кластеризации рецепторов TrkA и ß-интегрина в рафтах, обогащенных GM1, и активации тирозинкиназы TrkA рецепторов. В результате происходит активацию сигнальных каскадов (включая Akt и МАРК), которые активируются вслед за активацией тирозинкиназы TrkA рецепторов, что способствует росту аксонов [Ishikawa et al., 2009]. GM1 связывается с ламинином-1 через свой углеводный остаток. Интересно отметить, что асиало-GMl не связывается с ламинином-1, что свидетельствует о необходимости присутствия в молекуле ганглиозида сиаловой кислоты для его взаимодействия с ламинином. Кроме того, видимо, важную роль играет и пространственная конфигурация GM1, поскольку связывание с GDI а и GDlb, имеющими по две сиаловых кислоты в молекуле, происходит слабее, чем с ганглиозидом GM1 [Ishikawa et al., 2009]. Формированию аксонов и дендритов в процессе дифференцировки нейронов способствует и активация нейраминидазы, представляющей собой фермент, отщепляющий остатки сиаловой кислоты от основных ди- и трисиалоганглиозидов мозга с образованием GM1, обладающего наиболее выраженным нейритогенным эффектом [Ledeen, Wu, 2011]. Так, например, в присутствии нейраминидазы,