Активность экзооксидоредуктаз микроскопических грибов в связи с биодеструкцией ими природных и синтетических полимеров

• Автор: Касатова, Елена Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Е ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л Основные пути биоповреждение синтетических и природных

полимеров микроскопическими грибами

Е2 Биохимические особенности перокеидаз, фенолоксидаз и

каталаз грибов

1.3. Регуляция активности грибных перокеидаз,

фенолоксидаз и каталаз

1.4 Перекисное окисление липидов как интегральный показатель состояния метаболизма клеток миромицетов
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Методы исследования
2.3. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выявление наиболее активных микодеструкторов полимерных материалов различных групп
3.2. Изучение условий, наиболее благоприятных для проявления пероксидазной, фенолоксидазной и каталазной активности микромицетов-биодеструкторов
3.3 Влияние компонентов среды культивирования на пероксидазную, фенолоксидазную и каталазную активность микромицетов-биодеструкторов
3.4 Поиск путей регуляции экзооксидоредуктазной активности микромицетов-деструкторов полимеров
ВЫВОДЫ
Цитированная литература

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы
В настоящее время является актуальной проблема биодеградации синтетических и природных промышленных полимеров микроскопическими грибами. Одним из главных ее аспектов является исследование биохимических основ деструктивного процесса. Установлено, происходящее в ходе деструкции изменение физико - химических свойств материалов обусловлено преимущественно реакциями окисления и гидролиза ('Пграк, 1969). Интенсивность роста микромицетов и степень повреждения ими материала определяются как наличием или отсутствием в нем химических компонентов, способных поддерживать рост микромицетов, так и биохимическими особенностями биодеструкторов, в частности, наличием у них ферментных систем, позволяющих утилизировать различные синтетические и природные питательные субстраты (АН е! а1., 2009). Поэтому, зная негрибостойкие составляющие полимера можно предполагать участие тех или иных групп ферментов в процессе его деградации грибами (Аатег е! а1., 2008). При этом нахождение новых возможностей увеличения или снижения активности этих ферментов, а также изменения их продукции грибами при росте в присутствии различных полимеров может способствовать решению проблем ресурсосбережения, а также повышению степени экологической безопасности промышленных производств (АН е! а1., 2009).
Внеклеточные оксидоредуктазы (в частности пероксидазы, каталазы и фенолоксидазы) мицелиальных грибов в настоящее время активно исследуются как в связи с проблемой биодеструкции материалов, так и в связи с вопросами биоутилизации ксенобиотиков. Это связано с тем, что данные ферменты с одной стороны способны осуществлять окисление химических группировок широкого диапазона органических соединений, а с другой стороны могут повышать устойчивость этих организмов к внешним воздействиям (Головлева, Мальцева, 1987). Наиболее подробно
изучены оксидоредуктазы базидиальных грибов, в то время как литературные данные, касающиеся данных ферментов у дейтеромицетов, крайне противоречивы (Рабинович и др., 2004). При этом известно, что жизнедеятельность последних имеет важнейшее значение для протекания начальных этапов биодеструктивного процесса и подготовки компонентов материала к утилизации другими группами организмов- деструкторов (Головлева, Мальцева, 1987). В настоящее время открытыми остаются вопросы, касающиеся продуцирования, механизмов работы, путей активации и ингибирования, а также роли в деструкции различных органических соединений экзооксидоредуктаз данных грибов.
Цель исследования
Целью данного работы являлось исследование пероксидазной, каталазной и фенолоксидазной активности микромицетов- биодеструкторов промышленных материалов, изучение возможности участия данных ферментов в процессе биоповреждения природных и синтетических полимеров, а также установление влияния ряда химических соединений и слабого импульсного магнитного поля на их активность.
Задачи исследования
1. Определить видовой состав и выявить наиболее активных микодеструкторов материалов, в деградации компонентов которых могут принимать участие внеклеточные оксидоредуктазы.
2. Установить оптимальные значения pH среды и изучить динамику пероксидазной, фенолоксидазной и каталазной активности микромицетов-активных деструкторов данных полимеров.
3. Определить возможность участия указанных экзооксидоредуктаз в разрушении синтетических и природных полимеров.
4. Исследовать действие химических и физических факторов (фунгицидов “Катон ЬХЕ” и “Экодез”, сульфата меди (II), слабого импульсного магнитного поля) на пероксидазную, фенолоксидазную и каталазную активность изучаемых грибов

2.2.5.3. Определение активности внеклеточной фенолоксидазы
Определение активности фенолоксидазы проводилось спектрофотометрически по модифицированному методу Flurkey et al. (1995). В качестве субстрата использовали п-фенилендиамин (0,1 М). Измерения проводились приЯгаах = 535нм.
В кювету спекрофотометра толщиной 1см помещалось: 2мл буферного раствора рН=7,2; 0,5 мл 0,1М раствора п-фенилендиамина; 0,5 мл ферментативного препарата (КЖ). В контрольной кювете п-фенилендиамин заменяли водой.
Активность фенолоксидазы рассчитывалась по формуле: А
D х ос х ß х у

С xtxd
плотности реакционной смеси, d- толщина слоя жидкости в кювете, см.; t-время, мин.; axßx%- факторы разведения.
Результаты измерений выражались в условных единицах (у.е.). За единицу активности принималось приращение оптической плотности в 1 мл реакционной смеси за 1 минуту, в пересчете на 1 мг общего белка.
2.2.6. Определения концентрации белка
Содержание исследуемого белка в КЖ и в мицелии определялось методом Лоури - Фолина (Досон с соавт., 1991). В качестве стандарта использовался бычий сывороточный альбумин.
2.2.7. Определение содержания продуктов перекисного окисления в мицелии
2.2.7.1. Определение содержания диеновых и триеновых конъюгатов
Определение содержания диеновых (ДК) и триеновых (ТК) коньюгатов в мицелии проводилось по B.C. Камышникову (2000). 1г отфильтрованного мицелия растирался с 9мл фосфатного буфера рН=7,2. Затем к 1мл гомогената и добавлялось 4мл смеси гептана с изопропиловым спиртом (1:1). Данная смесь встряхивалась в течение 10 минут. Затем добавлялся 1мл 0,02 Н соляной кислоты и 2 мл гептана. Полученная смесь оставлялась на