Изучение свойств и регуляции металлопептидазы неприлизина в мозге и плазме крови млекопитающих

• Автор: Козлова, Дарья Игоревна
• Шифр специальности: 03.01.04; 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль протеолитических ферментов в функционировании организма

1.2. Ферменты семейства неприлизина

1.3. Неприлизин. Свойства и функции

1.4. Образование амилоидного пептида (А(3)

1.5. Свойства амилоидного пептида

1.5.1. Выведение АР из организма и мозга

1.6. Регуляция экспрессии неприлизина

1.6.1. Регуляция экспрессии неприлизина внутриклеточным фрагментом

белка предшественника амилоидного пептида (А1СО)
1.6.2. Альтернативные пути регуляция экспрессии неприлизина
1.6.3. Активность каспаз при действии патологических факторов
1.6.4. Гипоксия, как фактор, влияющий на изменение экспрессии и
активности неприлизина
1.7. Мягкое когнитивное снижение и болезнь Альцгеймера
1.8. Поиск маркеров для ранней диагностики болезни Альцгеймера
1.9 Заключение
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Экспериментальные животные
2.2. Модель пренатальной гипоксии
2.3. Анализ кратковременной памяти
2.4. Оценка кратковременной и долговременной памяти в
модифицированном тесте «распознавание новых объектов»
2.5. Введение ингибиторов каспаз в желудочки мозга крыс
2.6. Внутрибрюшинные введения крысам вальпроата натрия
2.7. Выделение мембраносвязанных фракций белков из структур мозга

2.8. Получение плазмы крови крыс
2.9. Культура клеток нейробластомы человека ЫВ7

2.10. Культивирование клеток нейробластомы человека N137 в
гипоксических условиях
2.11. Экстракция мРНК
2.12. Количественное определение РНК
2.13. Флуоресцентный метод определения активности неприлизина
2.14. Определения уровня связывания А1СЭ с промотором гена НЕП при
помощи метода иммунопреципитации хроматина
2.15. ПЦР в реальном времени
2.16. Определение концентрации белка
2.17. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ
2.18. Анализ белков с использованием иммуноблоттинга
2.19. Анализ экспрессии неприлизина методом иммуноцитохимии и
флуоресцентной конфокальной микроскопии
2.20. Обследование пациентов для постановки диагноза МКС или болезнь
Альцгеймера
2.21. Получение плазмы крови пациентов
2.22. Применение лекарственного препарата Цераксон®
2.23. Статистический анализ результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Изменение активности и экспрессии неприлизина в ткани мозга крыс
в ходе нормального онтогенеза и после пренатальной гипоксии
3.1.1. Возрастная динамика активности неприлизина в теменной коре и
гиппокампе мозга интактных крыс
3.1.2. Возрастная динамика активности неприлизина в теменной коре и
гиппокампе мозга крыс, перенесших пренатальную гипоксию
3.1.3. Анализ экспрессии неприлизина в теменной коре мозга молодых и
взрослых интактных крыс
3.1.4. Влияние старения и пренатальной гипоксии на изменение процессов
обучения и запоминания у крыс
3.2. Сравнительный анализ влияния пренатальной гипоксии на изменение
активности и экспрессии неприлизина в теменной коре и гиппокампе взрослых крыс
3.3. Исследование механизмов регуляции неприлизина с использованием

клеток нейробластомы человека NB
3.3.1. Влияние гипоксии на уровень экспрессии и активности неприлизина в 68 культуре клеток NB
3.3.2. Эффект гипоксии на активность членов семейства каспаз
3.3.3. Изменение уровня связывания транскрипционного фактора A1CD с
промотором гена НЕП при гипоксии
3.3.4. Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение активности неприлизина
при гипоксии
3.3.5. Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение уровня связывания AICD
с промотором гена НЕП при гипоксии
3.4. Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение экспрессии неприлизина
и содержание A1CD при гипоксии in vivo
3.5. Эпигенетическая регуляция экспрессии неприлизина вальпроатом
натрия in vivo
3.6. Влияние антиоксиданта эпигаллокатехин-3-галлата на активность
неприлизина в ткани мозга крыс
3.7. Изменение активности неприлизина в плазме крови крыс в норме и
после пренатальной гипоксии
3.8. Анализ активности неприлизина в плазме крови пациентов с мягким
когнитивным снижением и БА
3.9. Влияние фармакологического агента Цераксона® на изменение
активности неприлизина и состояния пациентов
4. ОБСУЖДЕНИЕ
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

эмбриогенеза приводит к комплексному нарушению формирования головного мозга (Roth and D’Sa, 2001), экспериментально вызванное снижение активности каспазы-3 у взрослых животных приводит к снижению способности к обучению. Предполагается, что изменение активности каспазы-3 влияет на синаптическую пластичность, поэтому её снижение может сопровождаться когнитивными дисфункциями (Gulyaeva, 2003; Kudryashova et al, 2009). В связи с этим использование различных ингибиторов каспаз может позволить скомпенсировать патологические изменения, вызванные действием гипоксии. Однако представления о молекулярно-клеточных механизмах действия ингибиторов каспаз не полные, что указывает на необходимость их всестороннего исследования, в том числе на животных и клеточных моделях.
Гипоксия и связанная с ней ишемия мозга являются одним из факторов, приводящих к развитию различных патологий мозга, в частности БА (Дубинина и др., 2015; Di Legge and, Hachinski, 2003; Egashira et al, 2002). Являясь наиболее распространенной патологией пренатального развития, гипоксия приводит к различным нарушениям в постнатальном онтогенезе и на физиологическом, и на биохимическом уровнях. Это может проявляться в нарушении когнитивных функций и изменении активности ферментов как в 1ДНС, так и в периферических органах и тканях.
1.6.4. Гипоксия, как фактор, влияющий на изменение экспрессии и активности неприлизина
Известно, что ЦНС является наиболее чувствительной к действию гипоксии (Самойлов, Рыбникова, 2012). Это вызвано тем, что действие гипоксии на любую животную ткань проявляется в изменении редокс-состояния клеток (которое сопровождается резким сдвигом pH в кислую сторону), в подавлении синтеза макроэргических соединений, в изменении ионной проницаемости и возбудимости плазматической мембраны. Последнее особенно важно потому, что состояние клеточных мембран нервной ткани является самым существенным фактором в обеспечении функциональной деятельности мозга (Аврова и др., 1993; Самойлов, 1999; Erecinska and Silver, 2001).
На начальной стадии кислородного голодания в нейронах наблюдается увеличение количества восстановительных эквивалентов и высвобождение мембраносвязанного кальция. В это время, однако, происходит активация компенсаторных процессов, сглаживающих на некоторое время неблагоприятное действия гипоксии. За счет накопления лактата активируются процессы гликолиза, более экономно расходуется энергия макроэргических соединений (угнетаются процессы пластического обмена).