Протеомные базы данных для поиска тканеспецифичных белковых маркеров мышечных органов

• Автор: Ковалева, Марина Анатольевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 353 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Глава 1 Протеомика постгеномного периода в разработках некоторых

биомедицинских проблем

1 1 Три периода в развитии протеомных исследований белков человека 1 2 Основные протеомные технологии и белковые базы данных, гипотетические (hypothetical), безымянные (unnamed) и некоторые другие малоизученные белки человека

12 1 Появление и развитие основных протеомных технологий

12 2 Компьютерные белковые базы данных и их роль в протеомных исследованиях

1 2 3 Гипотетические (hypothetical), безымянные (unnamed) и некоторые другие малоизученные белки человека

1 3 Исследования белкового полиморфизма и роль протеомных технологий

13 1 Общие представления о молекулярных основах биохимического полиморфизма белков

13 2 Протеомный подход в исследованиях биохимического полиморфизма белков

1 4 Протеомные методы в исследованиях белковых профилей при клеточной дифференцировке, в ходе онтогенеза и при злокачественной трансформации клеток человека
14 1 Протеомные исследования белковых профилей при клеточной дифференцировке на примере миогенеза
14 2 Изучение возрастных изменений белков человека протеомными методами (на примере некоторых мышечных органов)
14 3 Протеомика и рак (на примере рабдо- и лейомиосарком, а также злокачественных опухолей простаты)
1 5 Решение некоторых прикладных биомедицинских задач с помощью протеомных методов исследования
15 1 Поиск белковых биомаркеров отдельных физиологических и патологических процессов, а также белков - потенциальных мишеней для химиотерапевтических воздействий

15 2 Определение тканеспецифичных и других белковых биомаркеров в пищевой (мясной) промышленности
Глава 2 Материалы и методы исследований
2 1 Биологические материалы
2 1 1 Образцы тканей и других биоматериалов человека
2 12 Клеточные культуры
2 13 Образцы тканей лабораторных животных
2 14 Образцы коммерческой мясной продукции и исходного сырья
2 2 Химические реагенты
2 3 Протеомные методы исследования
2 3 1 Подготовка проб
2 3 2 Фракционирование белков двумерным электрофорезом по О Фарреллу
2 3 2 1 Фракционирование белков двумерным электрофорезом по О’Фарреллу с
использованием изоэлектрофокусирования в амфолиновом градиенте pH (ГЕБ-РАОЕ)
2 3 2 2 Изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле с градиентом pH, сформированном амфолинами
2 3 2 3 БЮБ-электрофорез в пластинах полиакриламидного геля
2 3 2 4 Фракционирование белков двумерным электрофорезом по О’Фарреллу с использованием изоэлектрофокусирования в иммоблиновом градиенте pH (ТРО-РАОЕ)
2 3 3 Детекция белков на гелевых пластинах Денситометрия двумерных электрофореграмм Архивирование гелевых пластин
2 3 4 Компьютерная денситометрия электрофореграмм
2 3 5 Масс-спектрометрическая идеи I ификация белков
2 4 Иммуноферментный анализ
2 5 Иммуноблоттинг
2 6 Выделение клеточной ДНК, полимеразная цепная реакция, секвенирование ампликонов
2 7 Получение из культивированных клеток линии 011-145 препаратов «Суммарные фосфопротеины»
2 8 Методы получения препаратов клеточных белков, составляющих ядерный протеом клеток линии Пи-145
2 9 Статистическая обработка результатов

Результаты исследований и их обсуждение
Глава 3 Протеомное изучение биохимического полиморфизма белков, обусловленного аминокислотными заменами, в некоторых тканях и культивируемых клетках человека Проблема «конфликтов» в аминокислотных последовательностях некоторых белков
З 1 Исследования биохимического полиморфизма белков, обусловленного единичными аминокислотными заменами (single amino acid substitution, SAAS)
З 1 1 Изоформы енолазы человека и их полиморфные варианты 3 12 Полиморфизм ДЗ,5-Д2,4-диеноил-коэнзим А изомеразы (SAAS 41Е—эА)
3 13 Новый вариант триозофосфатизомеразы 1 (SAAS 233G->D)
3 2 Проблема «конфликтов» в аминокислотных последовательностях некоторых белков человека, SNP’s и SAAS
Глава 4 Биохимические проявления дифференциальной генной экспрессии в некоторых мышечных органах человека, а также при клеточной дифференцировке и в онтогенезе
4 1 Протеомное изучение белков сердечной мышцы человека, включающее масс-спектрометрическую идентификацию 80 белковых фракций
4 2 Изучение полиморфизма некоторых мажорных белков в отдельных мышечных органах, содержащих поперечнополосатые и гладкомышечные ткани 4 3 Протеомные технологии в изучении дифференциальной генной экспрессии белков в культивируемых мышечных клетках человека
4 4 Онтогенетические изменения белкового профиля в образцах сердечной мышцы человека
4 4 1 Протеомное исследование белков миокарда человека в пренатальном онтогенезе
4 2 2 Протеомное исследование белков миокарда человека в постнатальном онтогенезе
Глава 5 Разработка общих принципов построения многомодульных протеомных баз данных и создание базы данных «Протеомика мышечных органов»
5 1 Разработка принципов построения многомодульных протеомных баз данных и общие характеристики базы данных «Протеомика мышечных органов»
5 2 Общая характеристика комплексного модуля «Белки миокарда»

В целом, современные методики, использующие технологии MALDI TOF MS или ESI MS, обеспечивающие определение масс пептидов, полученных после специфического расщепления анализируемого белка (peptide mass fingerprinting, пептидно-массовые «отпечатки пальцев»), позволяют идентифицировать белки с известной аминокислотной последовательностью. Поиск пептидов проводится по соответствующим базам данных с учетом проведенного расщепления [например, Patterson S et al. 1996 и др.]. Более широкие возможности открывает тандемная масс-спектрометрия (MS/MS), благодаря которой удается получить информацию о последовательности даже новых или так называемых безымянных белков [Fröhlich Т. et al. 2006; Kosako H., Nagano K. 2011 и др.]. Принцип MS/MS состоит в том, что ионизированные пептиды, выбранные по массе на первом этапе анализа, подвергаются дальнейшей фрагментации и затем по фрагментам пептидов устанавливается их аминокислотная последовательность [по Николаев Е.Н. 2007 и др.].
В геномном периоде также появилась протеомная технология, в которой сочетались достоинства методов масс-спектрометрии и аффинной хроматографии. Она получила название SELDI по соответствующей аббревиатуре от английского обозначения «surface-enhanced laser desorption/ionization», которое можно перевести как «усиленная поверхностью лазерная десорбция/ионизация» [Hutchens Т.W., Yip Т.Т. 1993]. В технологии SELDI фракционирование и идентификация белков достигается путем последовательного использования специальных хроматографических белковых чипов, соединенных с масс-спектрометрическим детектором. Белковый чип для SELDI обычно представляет собой пластинку с несколькими (например, с 8-ю) активными зонами для хроматографии на поверхности. На эту пластинку попадают образцы исследуемой жидкости на первой стадии анализа. В зависимости от типа чипа и используемого буфера, с активными зонами связываются разные наборы белков, а несвязавшиеся белки отмывают. После отмывки чип со связавшимися белками высушивают и наносят на матрицу. Затем полученный объект помещают в вакуумную камеру и пятна облучают лазером. Благодаря применению подобных белковых чипов (protein microarrays) достигается упрощенное хроматографическое фракционирование биологической жидкости перед масс-спектрометрическим анализом. Далее, ионизованные за счет энергии лазера белки, как в обычном процессе MALDI, отрываются от поверхности чипа, по вакуумной трубке летят к противоположно заряженному электроду и там детектируются. Исходя из особенностей технологии SELD1, этот вид протеомного анализа исходно был сориентирован на изучение белков в различных биологических жидкостях (плазма крови, моча и др.), что нашло отражение в ряде публикаций, но уже, в основном, в по-стгеномном периоде [Seibert V. et al. 2005; Pisitkun T. et al. 2006; Langbein S. 2008; Liu C., 2011].
К настоящему времени, общее количество публикаций, в которых использовались масс-спектрометрические технологии MALDI, ESI или SELDI, составляет уже несколько десятков