Генетические подходы к изучению гидрогеназы HydSL пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina

• Автор: Хуснутдинова, Анна Наилевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. МЕТАБОЛИЗМ ВОДОРОДА ПРОКАРИОТ
ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИДРОГЕН АЗ
2Л. Распространение гидрогеназ, их физиологическая роль и локализация
2.2. Классификация гидрогеназ
2.2.1. Те гидрогеназы
2.2.2. Бе-Бгидрогеназы
2.2.3. М-Бе гидрогеназы
2.2.3.1. Структура
2.2.3.2. Классификация М-Ре гидрогеназ
2.2.3.2.1. Группа 1. Водородпоглощающие М-Ре гидрогеназы
2.2.3.2.2. Группа 2. Цитоплазматические сенсорные гидрогеназы и водородпоглощающие М-Ре гидрогеназы цианобактериапъного типа
2.2.3.2.3. Группа 3. Обратимые гетеромулыпимерные цитоплазматические
М-Ре гидрогеназы
2.2.3.2.4. Группа 4. Н2- выделяющие, энергосберегающие мембрансвязанные
М-Ре гидрогеназы
2.2.3.3. Регуляция биосинтеза М-Ре гидрогеназ
2.2.3.4. Биосинтез М-Ре гидрогеназ
2.2.3.4.1. Биосинтез активного центра М-Бе гидрогеназ
2.2.3.4.2. Биосинтез Бе-Б кластеров
2.3. ІЧі-Ее гидрогеназы Т. гоаеорегйсіпа ВВ8
2.3.1. Общая характеристика Т. гогеорешста ВВБ
2.3.2. Гидрогеназы Т. говеореглісіпа ВВБ
2.3.2.1. НирБЬ-гидрогеназа
2.3.2.2. Сенсорная гидрогеназа НирЦУ
2.3.2.3. Обратимая НохУН-гидрогеназа
2.3.2.4. НусІБЬ-гидрогеназа
2.3.3 Сборка гидрогеназ в Т. говеореглісіпа
ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГИДРОГЕНАЗ

3.1. Генетические подходы для практического применения гидрогеназ
3.2. Гетерологичная экспрессия гидрогеназ
3.3. Использование генетических методов для изучения структуры Ni-Fe гидрогеназ
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1. Молекулярно-биохимические методы
4.1.1. Культивирование пурпурных бактерий
4.1.2. Культивирование Escherichia coli
4.1.3. Выращивание штаммов Е. coli — продуцентов структурных генов гидрогеназ для исследования продуктов гетерологичной экспрессии
4.1.4. Выращвание штаммов Е. coli — продуцентов структурных генов гидрогеназ для исследования активности продуктов гетерологичной экспрессии
4.1.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК из клеток Е. coli методом
щелочного лизиса
4.1.6. Выделение геномной ДНК пурпурных бактерий
4.1. 7. Выделение ДНК из геля
4.1.8. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
4.1.9. Лигирование векторов и фрагментов ДНК
4.1.10. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле
4.1.11. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК
4.1.11.1. Электропорация
4.1.11.2. Конъюгативный перенос плазмид в Т. roseopersicina
4.1.12. Получение электрокомпетентных клеток
4.1.13. ПЦР амплификация
4.1.14. Разработка олигонуклеотидных праймеров
4.1 15. Стабилизация гена hydS
4.1.16. Вертикальный электрофорез в ПААГ
4.1.17. Определение концентрации белка
4.1.18. Определение бактериохлорофилла а
4.1.19. Приготовление коллоидной серы
4.1.20. Определение концентрации сульфида
4.1.21. Определение гидрогеназной активности
4.1.21.1. Спектрофотометрический метод
4.1.21.2. Газохроматографический метод
4.1.21.3. Определение HydSL-гидрогеназной активности по восстановлению
серы до сульфида
4.2. Выделение и очистка гидрогеназы
4.2.1. Получение хроматофор
4.2.2. Получение экстракта клеток и очистка гидрогеназы
4.3. Методы исследования телец включения
4.3.1. Электронно-микроскопические методы
4.3.2. Выделение телец включения
4.3.3. Определение металлов
РЕЗУЛЬТАТЫ
ГЛАВА 5. СОЗДАНИЕ СИСТЕМЫ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ HYDSL-ГИДРОГЕНАЗЫ Т. ROSEOPERSICINA В Е. COLI
5.1. Амплификация генов hydS, hydL и hynD с геномной ДНК
Т. roseopersicina BBS
5.2. Создание генетических конструкций для экспрессии структурных генов гидрогеназы HydSL в клетках Е. coli
5.3. Изучение гетерологичной экспрессии структурных генов HydSL-гидрогеназы
Т. roseopersicina в клетках Е. coli
5.3.1. Экспрессия структурных генов гидрогеназы HydSL в клетках Е. coli
5.3.2. Исследование гидрогеназной активности штаммов Е. coli — продуцентов гидрогеназы HydSL
5.3.3. Электронная микроскопия штаммов Е. coli — продуцентов
гидрогеназы HydSL
5.3.4. Наличие Ni в тельцах включения гидрогеназы HydSL 65 ГЛАВА 6. СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ МОДИФИКАЦИИ HYDSL-ГИДРОГЕНАЗЫ Т. ROSEOPERSICINA В ГЕНОМЕ МАТЕРИНСКОГО ШТАММА
6.1. Создание конструкций для генетической модификации Т. roseopersicina
6.2. Постановка конъюгации Т. roseopersicina со штаммами Е. coli, несущими конструкции для двойной рекомбинации
6.3. Скрининг трансконъюгантов Т. roseopersicina
6.4. Исследование модифицированной гидрогеназы HydSL-6His
6.4.1. Определение локализации HydSL-eHis-гидрогеназы
6.4.2. Исследование физиологической функции HydSL-6His на целых тетках
6.4.3. Разработка системы очистки HydSL-eHis-гидрогеназы
Это связано с участием Hup-гидрогеназ в утилизаци водорода, выделяемого нитрогеназой и в результате с более эффективным использованием энергии в процессе азотфиксации. Поскольку большинство штаммов Rhizobium, которые потенциально возможно использовать для инфицирования бобовых не содержат генов Нир-гидрогеназ (Brewin et al., 1984), были предприняты попытки модификации имеющихся штаммов системой синтеза Hup-гидрогеназ с космиды (Brito et al., 2000). Была разработана система модификации штаммов R. leguminosarum bv. viciae PRE, Bradyrhizobium japonicum, R. etli и Mesorhizobium loti при помощи встраивания в геном минитранспозона ТпНВЮО со вставкой 18 т.п.о. фрагмента hup-тенного кластера R. leguminosarum bv. viciae UPM791, кодирующего как структурные, так и вспомогательные гены биосинтеза Hup-гидрогеназы (Bascones et al., 2000).
Попытки создания систем выделения водорода с участием модифицированных гидрогеназ как в гетерологичных, так и в гомологичных системах, также крайне интересны и заслуживают внимания. Для упрощения очистки гидрогеназ, применяются аффинные метки. Чаще всего используют полигистидиновые или стрептовидиновые метки как для Ni-Fe (Chandrayan et al., 2012; Palagyi-Meszaros et al., 2009) так и для Fe-Fe гидрогеназ (Girbal et al., 2005; King et al., 2006; Sybima et al 2008; Kuchenreuther et al., 2010; Yacoby et al., 2011, 2012). Для увеличения выхода гидрогеназы в Pyroccocus furiosus была усилена экспрессия растворимой четырёхсубъединичной гидрогеназы за счёт замены промотора, при этом к гидрогеназе была присоединена аффинная стрептовидиновая метка для упрощения процесса очистки (Chandrayan et al., 2012). Гомологичная экспрессия двух субъединиц четырёхсубъединичной цитоплазматической гидрогеназы P. furiosus под сильным промотором была осуществлена в штамме P. furiosus с делегированными гидрогеназами. При этом было показано наличие взаимодействия «усечённой» гидрогеназы с пируват-оксидоредуктазным комплексом, т.о. гидрогеназа могла получать электроны напрямую от пирувата, в обход NADPH (Hopkins et al., 2011), что и было показано ранее для мембансвязанной гидрогеназы P. furiosus (Sapra et al., 2003). И хотя при этом у двухсубъединичного фермента частично терялась термостабильность и толерантность к кислороду, эта идея была в дальнейшем реализована в гетерологичной системе синтеза пируват-оксидоредуктазного комплекса совместно с ферредоксином и Fe-Fe гидрогеназы в Е. coli (Agapakis et al., 2010). Для оптимизации электронтранспортного пути подбирали длину линкера, сшивающего гидрогеназу с ферредоксином, а также компартментализовали пируват-оксидоредуктазу, ферредоксин и гидрогеназу при