Изменения структуры и свойств тропомиозина при стабилизации и дестабилизации различных участков его молекулы

• Автор: Невзоров, Илья Анатольевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 134 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Структура тропомиозина
1. Открытие тропомиозина и первоначальные сведения о его структуре
2. Структура соПей-соИ: основные черты и номенклатура
Факторы, определяющие стабильность структуры СС
3. Тропомиозин: распространение и изоформы
4. Особенности первичной структуры ТМ
5. Стабильность молекулы ТМ
6. Атомные структуры тропомиозина
II. Функциональные свойства тропомиозина
1. Взаимодействие ТМ с фибриллярным актином
Ко оперативность взаимодействия и факторы, ее определяющие
Факторы, определяющие сродство ТМ к Р-актину
Гипотеза 0ез1аи-связываиш
2. Регуляторная функция ТМ
Общие сведения о механизме мышечного сокращения
Регуляция взаимодействия головки миозина с актиновым филамептном
III. Миопатические мутации в тропомиозинах
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Препаративные методы
Приготовление компетентных клеток Е.соИ
Сайт-направпенный мутагенез
Экспрессия рекомбинантного ТМ в клетках Е. соИ
Выделение актина из ацетонового порошка
Выделение субфрагмента 1 миозина (Б1)
Выделение тропопина из ацетонового порошка мышц кролика
Получение ТМ, меченого Н-(1-пиренил)йодацстамидом
2. Аналитические методы
Определение концентрации белков
8П8-Электрофорез в ПААГ
Образование дисульфидной связи с помощью
5,5’-дитиобис(2-нитробензоата)
Ограниченный протеолиз тропомиозина трипсином
Соосаждение тропомиозина сР- актином
Определение Са2+ -чувствительности реконструированного топкого филамента
Исследования тепловой денатурации ТМ методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)
Спектроскопия кругового дихроизма
Исследование температурных зависимостей диссоциации комплекса ТМ с Г-актином методом светорассеяния
Температурные зависимости эксимерной флуоресценции пирепил-меченого тропомиозина
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава I. Исследование структуры и свойств Р-тропомиозина,
несущего мутацию 1191С
I. 1. Термостабильность Р-тропомиозина (Р-ТМ) и влияние на нее мутации 1191С
1.1.1. Гладкомышечный ф-тропомиозин (р-8тТт)
1.1.2. Скелетный Р-тропомиозин ф-БкТт)
I. 2. Способность Р-ТМ к формированию ар-гетеродимеров с а-ТМ
и влияние на нее мутации 1191 в
1.2.1. Образование гетеродимеров между а- и р-цепями ТМ
1.2.2. Влияние мутации 1191 б в гладкомышечном Р-ТМ на его способность образовывать аР-гетеродимеры с а-ТМ
I. 3. Влияние мутации 11910 в р-ТМ на его взаимодействие с Е-актином
1.3.1. Гладкомышечный Р-тропомиозин (Р-БтТт)
1.3.2. СкелетныйР-тропомиозин (Р~8кТт)
Глава II. Роль остатка С1у-126 в структуре и функциях ТМ
III. Консервативный неканонический остаток С1у-126 дестабилизирует
центральную часть молекулы ТМ
II. 1.1. Изучение локальной стабильности а-БкТт ЯТГ и его мутантов
о.-8кТт а26А и а-8кТт 012611 методом ограниченного протеолиза
II. 1.2. Изучение тепловой денатурации а-8кТт 1УТ и его мутантов —
а-БкТт 0126А и а-8кТт 012611
11.1.3. Тепловая денатурация а-ТМ и его мутантов в присутствии
И-актина
II.2. Влияние стабилизации центральной части а-БкТМ на его
функциональные свойства
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
G-актин глобулярный актин
F-актин фибриллярный актин
АТР аденозинтрифосфат
БСА бычий сывороточный альбумин
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНКаза I дезоксирибонуклеаза I
ДСК дифференциальная сканирующая калориметрия
ДТНБ 5,5’-дитиобис(2-нитробензойная кислота)
DTT дитиотреитол
КД круговой дихроизм
ПААГ полиакриламидный гель
Трис трис-(гидроксиметил)-метиламин
Р-МЕ Р-меркаптоэтанол
Hepcs М-(2-гидрокситгил) пиперазин ->Г-(2-этаносульфоновая
кислота)
S1 субфрагмент 1 миозина
SDS додецилсульфат натрия
ТМ тропомиозин
ПЦР полимеразная цепная реакция
приблизительно в 10-30 раз более слабым, чем у ТМ дикого типа. Напротив, делеция повтора 5 (и, особенно, его N-концевой части, остатки 166-186), приводила к потере сродства ТМ к актину как в присутствии, так и в отсутствие головки миозина (S1) [Hitchcock-DeGregori and Vamell, 1990; Hitchcock-DcGrcgori and An, 1996; Hammell and Hitchcock-DeGregori,1997; Hitchcock-DeGregori et al., 2002]. Схожим образом, замещение аминокислотной последовательности повторов на последовательность транскрипционного фактора GCN4, также обладающего структурой СС, имело драматические последствия только в случае повтора 5 [Hitchcock-DeGregori et al., 2002]. Повтор 5 обладает наиболее консервативной последовательностью по сравнению с другими повторами: 31% его последовательности идентичен у представителей животных, тогда как для остальных повторов этот показатель составляет 17%. N-концевая часть повтора 5 (остатки 166-186) характеризуется еще большей консервативностью - 38%. Последовательность повтора 5 кодируется экзоном 5, который никогда не подвергается альтернативному сплайсингу [Perry, 2001; Gunning et al., 2005]. Что же делает повтор 5 таким уникальным с точки зрения актин-связывающей функции 'ГМ? Hitchcock-DeGregori и Singh обратили внимание на то, что в структуре повтора 5 имеется аланиновый кластер А1а179—Alal83—Serl86, т.е. один из тех дестабилизирующих кластеров, о которых говорилось выше. Такое наблюдение сразу породило мысль о том, что именно дестабилизация структуры повтора 5 может иметь немалое значение для связывания ТМ с актином. Для проверки этого предположения авторы сконструировали мутантный ТМ, в котором последовательность аланинового кластера была заменена на более гидрофобные и потому стабилизирующие остатки (Alal79Leu-Tr Alal83Val-Serl86Leu). Эксперименты показали, что такие замены действительно вызывали повышение термостабильности молекулы ТМ, а изучение температурных зависимостей флуоресценции эксимеров пиренил-иодацитамида, связанного с Cys-190, подтвердило локальную стабилизацию данного участка молекулы ТМ. Кроме того, замена дестабилизирующего кластера на стабилизирующий вызывала драматическое снижение сродства ТМ к F-актину [Hitchcock-DeGregori and Singh, 2006]. Таким образом, было показано, что дестабилизация структуры СС в районе повтора 5 за счет присутствия в гидрофобном коре неканонических остатков является необходимым условием для связывания ТМ с актином. Кроме того, в данной работе [Hitchcock-DeGregori and Singh, 2006] авторы также демонстрируют необходимость наличия консервативных (в основном, кислых) остатков в положениях Ь, с и/гептадного повтора СС. Напомню, что аминокислотные остатки в этих положениях находятся на поверхности двойной спирали ТМ и могут образовывать контакты с поверхностными остатками актиповой нити.