Молекулярный механизм генерации мембранного потенциала цитохром с оксидазой

• Автор: Силецкий, Сергей Алексеевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 180 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика цитохромоксидазы
1.2. Кристаллическая структура цитохромоксидазы
1.3. Редокс-центры и субъединицы каталитического ядра цитохромоксидазы
1.4. Пути проведения протонов, переноса молекулярного кислорода и воды
1.5. Физико-химические свойства цитохромоксидазы
1.6. Подходы к изучению переноса зарядов в цитохромоксидазе с временным разрешением
1.7. Промежуточные состояния в каталитическом цикле цитохромоксидазы
1.8. Представления о сопряженном протонном транспорте в цитохромоксидазе, базирующееся на стационарных измерениях
1.9. Структурно-функциональные особенности цитохромоксидазы Ъаз из ТлУїегторІгіІш
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Митохондриальная цитохромоксидаза
2.2. Штамм ЯкойоЬасіег sphaeroid.es
2.3. Выращивание клеток и получение мембран из клеток Я. хркаегоісіех
2.4. Изоляция цитохромоксидазы ддз из К.хркаегоісіех
2.5. Определение активности цитохромоксидазы ааз из К.хрИаегоісіех
2.6. Цитохромоксидаза Ъаъ из ТЬегтих 1кегторЫ1их
2.7. Встраивание цитохромоксидазы в протеолипосомы
2.8. Электрометрические измерения с использованием трис(бипиридил)рутения
2.9. Электрометрические измерения с ипользованием метода “флоу-флэш”
2.10. Спектрофотометрические кинетические измерения на одиночной длине волны
2.11. Разрешенная во времени регистрация спектров ЦО в оптическом диапазоне в сочетании с методом “флоу-флэш”
2.12. Обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Генерация мембранного потенциала, сопряженная с одноэлектронными переходами в каталитическом цикле цитохромоксидазы

3.1.1. Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 4-го электрона в каталитическом цикле цитохромоксидазы (Б—»О переход).
3.1.2. Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 1-го и 3-го электронов в каталитическом цикле цитохромоксидазы (фотовосстановление состояний О и Р).
3.2. Кинетика переноса электрона через гемовые центры в одноэлектронных переходах каталитического цикла цитохромоксидазы.
3.3. Внутрибелковые пути переноса протонов в ходе одноэлектронных переходов каталитического цикла цитохромоксидазы.
3.3.1. Электрогенная активность цитохромоксидазы аа3 из ЕкосІоЬасІег хрИаегоккх дикого типа.
3.3.2. Роль входных протонных Б и К каналов в каталитическом цикле цитохромоксидазы.
3.4. Артикуляция внутрибелкового перемещения протонов в одноэлектронном переходе Р—>0 цитохромоксидазы.
3.4.1. Стехиометрия сопряженного электрогенного переноса протонов в одноэлектронном переходе Б—эО.
3.4.2. Последовательность проведения помпируемого и субстратного протонов в переходе Р—>0 цитохромоксидазы.
3.4.3. Высвобождение протона на внешнюю сторону мембраны. Ионы цинка - как ингибитор электрогенного переноса протонов в цитохромоксидазе.
3.5. Особенности одноэлектронных переходов в каталитическом цикле цитохромоксидазы Ъаз из ТлИегторИПш
3.5.1. Электрогенные события, сопряженные с переносом на кислород 1-го электрона в каталитическом цикле цитохромоксидазы баз (фотовосстановление состояний О).
3.5.2. Интермедиаты каталитического цикла, разрешаемые при окислении кислородом восстановленной цитохромоксидазы баз из ТЛІгегторкіІш в режиме одного оборота.
3.5.3. Стадии генерации мембранного потенциала, сопряженные с окислением восстановленной баз оксидазы из ТлкегторкИих кислородом в режиме одного оборота
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЦО - цитохромоксидаза
BNC - биядерный каталитический сайт
PLS - протон-загрузочный сайт
ЛцН+ - разность электрохимических потенциалов ионов водорода
АТ - разность электрических потенциалов
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ДНКаза 1 - дезоксирибонуклеаза
ФМСФ (PMSF) - фенилметансульфонилфторид
ДТТ - дитиотреитол
ТМФД - (N1 - тетраметил-п-фенилендиамин
Трис - трис(гидроксиметил)метиламин
HEPES - N-2-гидроксилэтилпиперазин-М-2-этансульфоновая кислота
CHES - 2-(циклогексиламино)этансульфоновая кислота
SVD (singular value decomposition) - разложение по сингулярным значениям
MV - форма фермента смешанной валентности
Kd - константа диссоциации
коп - константа скорости связывания второго порядка kotr - константа скорости диссоциации Rubpy - Ru(2,2'- бипиридилДСЬ
R2C - {Щи(2,2’(бипиридин)2]2(1,4-бис[2-(4'-метил-2,2'-бипиридил)этенил]бензол)}
Ru-102-Cyt-c - дрожжевой цитохром с, модифицированный по остатку С102 трис-бипиридил-рутениевым комплексом.
FTIR - ИК спектроскопия с использованием преобразования Фурье Ет - среднеточечный редокс-потенциал ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

деструкцию ферментов, освобождающихся из мембран, к последним добавляли ФМСФ (ингибитор протеаз). Солюбилизированные мембраны затем центрифугировали (75000 g, 35 минут, 4° С) и отбирали супернатант. К супернатанту добавляли имидазол (или гистидин) в концентрации 10 мМ и Ni-NTA сефарозу Quiagen (США) из расчета 0.5 мл/мг оксидазы. Полученную суспензию инкубировали при постоянном перемешивании в течение 1 часа при 4° С.
Суспензию наносили на хроматографическую колонку (d~30 мм; Sigma). После нанесения, колонку промывали буфером со скоростью ~5 мл/мин 10 объемами буфера (50 мМ КН2РО4, pH 8.0, 10 мМ имидазола, 0.1% додецил мальтозида) и пятью объемами того же буфера, но содержащего 15-20 мМ имидазола. Цитохромоксидазу снимали с колонки буфером (50 мМ КН2РО4, pH 8.0, 100-150 мМ имидазол, 0.1% додецил мальтозида) со скоростью ~0.1 мл/мин. Полученый препарат изолированного фермента обычно имеет концентрацию около 5-10 мкМ. Препарат очищенной цитохромоксидазы избавляли от имидазола методом гельфильтрации или с помощью процедуры последовательного разведения и концентрирования центрифугированием на фильтрах Amicon (США). Препарат фермента с конечной концентрацией (50-100 мкМ) замораживали в жидком N2.
2.5. Определение активности цитохромоксидазы аа? из R.svhaeroides.
Активность ЦО из R.sphaeroides определялась спектрофотометрически по скорости окисления 30 мкМ цитохрома с в 50 мМ КН2РО4 буфере (рН=6.5), в присутствии 0.02% лаурил мальтозида, при 25° С.
2.6. Цитохуомоксидаза bat из Thermus thermoyhilus
Цитохромоксидаза была очищена из клеток штамма T.thermophilus НВ8 (АТСС 27634) согласно (172), и предоставлена в рамках совместного сотрудничества лабораторией проф. Т. Сулейман (Люмерик, Ирландия).
2. 7. Встраивание иитохромоксидазы в пуотеопипосомы.
Для встраивания цитохромоксидазы в протеолипосомы использовались методы Рэкера и Риго (182-183). Фосфатидилхолин (азолектин) суспендировали в 2% растворе холата натрия в буфере (50 мМ КН2РО4, рН=7.5, 2 мМ MgS04,). Концентрация фосфолипида составляла 40-60 мг/мл. Суспензию продували аргоном и озвучивали в ледяной бане (с добавлением NaCl) 3-4 раза по 30 секунд до просветления с помощью ультразвукового дезинтегратора (0.4 А, 22 кГц). Затем добавляли ЦО до концентрации