Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA): координатор клеточных функций в норме и патологии

• Автор: Нарыжный, Станислав Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 265 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. РСИА, ОСНОВНЫЕ ФАКТЫ

1.2. МЕСТО РСИА В ПРОТЕОМЕ (БАЗЫ ДАННЫХ 2БЕ)

1.3. РСИА И ПРОТЕОМ ПРИ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ

1.4. РСИА И КАНЦЕРОГЕНЕЗ

1.5. ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ

1.5.1. Убиквитинирование и БЕГМО-илирование

1.5.2. Убиквитинирование РСИА может быть механизмом переключения работы полимераз

1.5.3. Фосфорилирование
1.5.4. Ацетилирование
1.6. СТРУКТУРА РС1ЧА
1.6.1. Мономеры РС1ЧА образуют тример в виде кольца
1.7. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РС1ЧА
1.7.1. Структурные аспекты взаимодействий РС151А
1.7.2. Репликация ДНК
1.7.3. Репарация ДНК
1.7.4. Контроль клеточного цикла, выживаемость
1.7.5. Сборка хроматина, эпигенетика и когезия хроматид
1.7.6. Транскрипция и другие разнообразные функции
1.7.8. Гликолиз
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реагенты
Антитела

Клетки, клеточные культуры и клеточные экстракты
Плазмиды
Синхронизация по клеточному циклу
Сортировка клеток (FACS)
Мечение in vivo
Субклеточное фракционирование
Клеточная трансфекция
Выделение PCNA хроматографией и электрофорезом
Сшивки формальдегидом
Одномерный электрофорез (SDS-PAGE)
Нативный электрофорез
Голубой нативный электрофорез (BNPAGE)
Двумерный электрофорез (2DE)
Окрашивание белков и сушка гелей
Иммуноосаждение
Перенос на мембрану
Окрашивание мембран
Иммунодетектирование
Г олубой сухой Вестерн-блот
“Классический” Вестерн-блот
Фар-Вестерн
Моделирование
Иммуноокрашивание клеток
Белки и ферменты
Масс-спектрометрия
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3 Л. PCNA В ПРОТЕОМЕ

3.2. PCNA В ФАЗАХ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
3.3. PCNA И КАНЦЕРОГЕНЕЗ
3.3.1. Профили PCNA нормальных и раковых клеток
3.4. ПОСТТРАСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ PCNA
3.4.1. Низкомолекулярные фрагменты PCNA
являются результатом действия протеосом
3.4.2.Протеолиз PCNA in vitro может происходить во время изоэлектрофокусирования
3.4.3. Протеолиз PCNA является убиквитин-зависимым
3.4.4. Правильная структура PCNA жизненно важна для
клеточных функций 13
3.4.5. PCNA не фосфорилирован in vivo -
3.4.6. PCNA может быть ацетилирован in vivo
3.4.7. Субклеточная локализация изоформ PCNA в контексте клеточного цикла
3.4.8. Ацетилирование и деацетилирование PCNA может
происходить с помощью ацетилазы рЗОО и деацетилазы ITDAC
3.4.9. Ацетилированный PCNA имеет большее сродство
к ДНК-полимеразам, чем деацетилированный PCNA
3.5. СТРУКТУРА PCNA
3.5.1. PCNA млекопитающих организован
в виде двойного тримера
3.5.2. Аминокислотные остатки Arg-5 и Lys-110 являются критическими для формирования двойного тримера PCNA
3.5.3. Образование двойного тримерного комплекса PCNA существенно для деления и выживаемости
клеток млекопитающих

1.6. СТРУКТУРА PCNA
1.6.1. Мономеры PCNA образуют тример в виде кольца
Первичная структура PCNA очень мало изменилась в течение эволюции, и его аминокислотные последовательности у человека и крысы отличаются только по четырем из 261 аминокислот. Как было показано с помощью кристаллографии и малоуглового нейтронного рассеяния, PCNA организован в тороидальную структуру (Рис.4) (Krishna. Kong et al. 1994; Gulbis. Kelman et al. 1996: Schurtenberger. Egelhaaf et al. 1998; Ellison and Stillman 20011. Такая кольцевая организация характерна и очень похожа у факторов типа “скользящей скрепки”, необходимых для процессивного синтеза ДНК у бактериофагов, археи и эукариотов ('Ellison and Stillman 2001: Majka and Burgers 2004). Например, белковые структуры PCNA у Saccharomyces cerevisiae и у человека практически совместимы и совпадают по всем ключевым элементам, хотя их аминокислотные последовательности имеют только 35% гомологии. Каждый мономер PCNA состоит из двух доменов, которые прочно соединяются друг с другом посредством бета структур, образованных на границе между доменами (Krishna. Kong et al. 1994: Gulbis. Kelman et al. 19961. Три мономера в свою очередь соединяются также через взаимодействие антипараллельных участков бета-листов (BD2 в одной молекуле и ßll в другой), что приводит к образованию 8 амид-карбоксил водородных связей на границе межмолекулярного взаимодействия (Рис.4) (KrishnaJKpng_et_aL 1994: Gulbis. Kelman et al. 1996V В дополнение образуется гидрофобное ядро, где упакованы вместе ссА2 спираль одной молекулы и аВ1 спираль другой молекулы PCNA (Krishna. Kong et al. 1994). Конечная структура тримера PCNA имеет внешний диаметр -80Ä, внутренний диаметр -34Ä