Получение и иммунохимический анализ рекомбинантных фактора роста эндотелия сосудов и его первого растворимого рецептора

• Автор: Леопольд, Анна Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

Оглавление
Список использованных сокращений
Введение
1. Получить штамм E.coli эффективно продуцирующий рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов крысы VEGF
2. Получить штаммы E.coli эффективно продуцирующие рекомбинантные, VEGF-связывающие фрагменты растворимого первого рецептора фактора роста эндотелия сосудов человека sVEGFR-1 (sFlt-1)
3. Разработать метод очистки рекомбинантного VEGF и рекомбинантных лиганд-связывающих фрагментов sFlt-1 из клеток E.coli
Глава 2. Обзор литературы
2. F Общая характеристика белков семейства VEGF
2.2 Структура гена VEGF и альтернативный сплайсинг мРНК VEGF
2.3. Рецепторы VEGF и особенности VEGF/VEGFR-2 сигналлинга
2.4. Роль VEGF-А в васкулогенезе и в нормальном и патологическом ангиогенезе
2.5. VEGF как мишень для антиангиогенной терапии
2.6. sVEGFR-1 как естественный антиангиогенный фактор и как маркер различных патологических состояний
2.7. Получение рекомбинантных VEGF и VEGFR-1 в различных системах экспрессии
2.8. Заключение
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Полимеразная цепная реакция
2.2 Выделение плазмидной ДНК
2.4 Выделение ДНК из реакционных смесей на силика-спин колонках

2.5 Электротрансформация и приготовление электрокомпетентных клеток
2.6 Молекулярное клонирование
2.7 Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.8 Культивирование Е.соН и анализ интенсивности экспрессии рекомбинантных белков
2.9 Выделение и ренатурация рекомбинантных белков
2. 10 Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.11 Вестерн-блоттинг
2.12 Метод твердофазного лиганд-рецепторного анализа
2.13 Исследование активности полученных белков на культуре клеток глиомы С6 и на культуре клеток НЦУЕС
2.14. Исследование клеточной адгезии
Глава 3. Собственные результаты
3.1 Получение препарата рекомбинантного белка УЕОР крысы
3.1.1 Клонирование гена УЕОР в экспрессирующие векторы
3.1.2 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков Щх/УЕвР и УЕвР в Е.соН
3.1.3 Очистка рекомбинантного УЕОР и 1хх|УЕСР с помощью металлафинной хроматографии на 1912+-1чГТА агарозе. Ренатурация 1тх|УЕОР и УЕОР
3.1.4 Иммунохимический анализ рекомбинантного УЕОР
3.2 Получение препаратов рекомбинантных фрагментов экстраклеточного домена УЕОР11-1 человека
3.2.1 Клонирование генов кодирующих УЕОР-связывающие фрагменты экстраклеточного домена УЕСРЯ-1 в экспрессирующие векторы

3.2.2 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков ЦтфРк-1(2-3) и эРк-1(1-3) в Е.соН. Ренатурация рекомбинантных ЕхфРк-1(2-3) и зРк-1(1-3)
3.2.3 Иммунохимический и анализ рекомбинантных 1гх|зРк-1(2-3), эРк-1(2-
3)изРк-1(1-3)
3.3 Исследование биологической активности полученных рекомбинантных белков
3.3.1 Исследование биологической активности рекомбинантных белков УЕвР и 1гх|УЕСР
3.3.2Ингибирование растворимым 1хх|зРк-1(2-3) восстановления монослоя клеток глиомы С6
Глава 4. Обсуждение результатов
Список литературы
нейтрализующего раствора из вышеупомянутого набора и перемешивали содержимое пробирки до образования однородной творожистой взвеси. Получившуюся смесь инкубировали 1 минуту, после чего центрифугировали в настольной центрифуге (Eppendorf, Германия) на максимальной скорости. Спин-колонку из соответствующего набора помещали в собирательную пробирку и помещали туда осветленный супернатант из предыдущего этапа. Колонку центрифугировали 30 секунд на максимальной скорости, в результате чего плазмидная ДНК сорбировалась на силиконовом носителе колонки. Из собирательной пробирки удалялся фильтрат, в колонку добавлялось 300 мкл промывочного раствора из вышеупомянутого набора для выделения плазмидной ДНК (предварительно в раствор было добавлено 94 мл этилового спирта (96%)) после чего колонка центрифугировалась еще 30 секунд. Стадия промывки повторялась еще один раз и после этого колонка центрифугировалась на максимальной скорости еще 2 минуты, для полного удаления «промывочного раствора». В центр мембраны далее наносилось около 50 мкл стерильной деионизированной воды, после чего пробирка с колонкой инкубировалась 60 сек при комнатной температуре и центрифугировалась в течение 30 секунд. Собранный элюат использовался тут же или хранился при -20°С.
2.4 Выделение ДНК из реакционных смесей на силика-спин колонках.
Выделение ДНК из реакционных смесей (после ПНР, рестрикции и лигирования) осуществлялась с помощью силика-спин колонок (Boom et al. 1990) с помощью набора для выделения ДНК из геля и реакционных смесей «Cleanup standart» (Евроген, Россия). К одному объему реакционной смеси добавляли 5 объемов «связывающего раствора», после чего раствор перемешивали и переносили в колонку, предварительно помещенную в микроцентрифужную пробирку (Eppendorf). Пробирку с колонкой центрифугировали на максимальной скорости в настольной центрифуге в