Стимуляция ангиогенеза с помощью генетически модифицированных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, гиперэкспрессирующих фактор роста эндотелия сосудов

• Автор: Шевченко, Евгений Константинович
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ФОРМИРОВАНИЕ И ПОДДЕРЖАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ СОСУДИСТОЙ СЕТИ В ПОСТНАТАЛЬНЫЙ ПЕРИОД

1.1. Ангиогенез

1.3. Артериогенез. Коллатеральный кровоток

1.4. Постнатальный васкулогенез

2. ФАКТОР РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ: РОЛЬ В ПОСТНАТАЛЬНОЙ ВАСКУЛЯРИЗАЦИИ

2.1. Характеристика семейства УБвР

2.2. Рецепторы УЕвГ

2.3. Роль УЕвР в эмбриональном и постнатальном периоде развития организма
3. ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АНГИОГЕНЕЗ ПРИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА И НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ
3.1. Рекомбинантные ангиогенные факторы в терапевтическом ангиогенезе25
3.2. Генная терапия в терапевтическом ангиогенезе
3.3. Клеточная терапия в терапевтическом ангиогенезе
4. МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ
4.1. Выделение, антигенная характеристика и пластичность СКЖТ
4.2. Ангиогенный и регенеративный потенциал СКЖТ
5. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ КЛЕТОК КАК СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕННОЙ И КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ
5.1. Актуальность генетического модифицирования клеток
5.2. Системы доставки генетического материала в клетки и ткани
5.2.1. Невирусные системы доставки
5.2.2. Перенос генов с помощью рекомбинантных вирусных векторов
5.2.2.1. Онкоретровирусы и лентивирусы
5.2.2.2. Аденовирусы
5.2.2.3. Вирус простого герпеса
5.2.2.4. Аденоассоциированный вирус

5.2.2.5. Бакуловирусы
5.2.2.6. Вирусоподобные частицы
5.3. Генетическое модифицирование клеток с целью повышения их паракринной активности
5.3.1. Предшественники эндотелиальных клеток
5.3.2. Скелетные миобласты
5.3.3. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга
5.4. Генетическое модифицирование клеток для улучшения их хоуминга и выживаемости после трансплантации
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
1.1. Конструирование плазмиды pAAB-hVEGF
1.2. Рестрикция плазмид
1.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле
1.4. Экстракция ДНК из агарозного геля
1.5. Лигирование фрагментов ДНК
1.6. Получение компетентных клеток E. coli, штамм DH5a
1.7. Трансформация E
1.8. Выделение и очистка плазмид ной ДНК
1.9. Выделение РНК
1.10. Реакция обратной транскрипции и полимеразно-цепная реакция в реальном времени
1.11. ДСН-электрофорез. Иммуноблоттинг
1.12. Определение VEGF165 человека методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА)
2. ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
2.1. Культивирование эукариотических клеток
2.2. Выделение СКЖТ человека
2.3. Плазмидная трансфекция клеток
2.4. Продукция рекомбинантного аденоассоциированного вируса и
трансдукция клеток
2.5. Получение кондиционированных сред
2.6. Оценка пролиферативной активности СКЖТ
2.7. Оценка распределения СКЖТ по фазам клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии
2.8. Анализ частоты спонтанного апоптоза СКЖТ
2.9. Адипогенная и остеогенная дифференцировка СКЖТ
2.10. Эндотелиальная дифференцировка СКЖТ

2.11. Анализ клеточной адгезии
2.12. Проточная цитофлуориметрия
2.13. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток на культуральных плашках
3. ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА ЖИВОТНЫХ
3.1. Экспериментальные животные
3.2 Имплантация клеток в матригеле
3.3 Модель ишемии задней конечности
3.4 Лазерная допплерография
3.5 Модель эксплантной культуры скелетной мышцы
4. ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
4.1 Подготовка тканей
4.2 Иммунофлуоресцентное окрашивание образцов мышечной ткани и матригелей
4.3 Окрашивание мышечной ткани на коллаген при помощи пикросириуса красного
4.4 Окрашивание мышечной ткани гематоксилином-эозином
5. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
6. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПЛАЗМИДНОЙ ТРАНСФЕКЦИИ СКЖТ ЧЕЛОВЕКА
2. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ СКЖТ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОШЬЮ РЕКОМБИНАНТНОГО АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА
3. УВЕЛИЧЕНИЕ СЕКРЕЦИИ УЕСБ МОДИФИЦИРОВАННЫМИ СКЖТ ЧЕЛОВЕКА
4. АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ УЕСЬ НА ПОВЕРХНОСТИ СКЖТ
5. ВЛИЯНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МОДИФИЦИРОВАНИЯ СКЖТ НА ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ СТАТУС И ЧАСТОТУ СПОНТАННОГО АПОПТОЗА

аутологичных свежевыделенных СКЖТ подкожной жировой клетчатки, больным острым инфарктом миокарда [Meliga, 2007].
5. Генетическое модифицирование клеток как способ повышения эффективности генной и клеточной терапии
5.1. Актуальность генетического модифицирования клеток
Несмотря на успешные экспериментальные исследования в области генной и клеточной терапии, данные большого числа клинических испытаний не дали однозначных результатов и ожидаемой эффективности. При обсуждении причин недостаточной эффективности генной и клеточной терапии при заболеваниях ишемического генеза в случае генной терапии указывают на низкую эффективность трансфекции тканей человека, недостаточную длительность экспрессии трансгена при использовании безопасных плазмидных конструкций, иммунные реакции, а также опасность инсерционного мутагенеза, ограничивающие использование вирусных конструкций. Наиболее существенной проблем аутологичной клеточной терапии является гибель значительного количества клеток после трансплантации в поврежденную и ишемизированную ткань, а также снижение регенеративных свойств и функциональной активности клеток у пожилых людей и больных с диабетом, атеросклерозом коронарных артерий и сердечной недостаточностью [Vasa, 2001; Террег, 2002; Heeschen, 2004; Valgimigli, 2004; Heeschen, 2004; Stolzing, 2008; Giannotti, 2010; Sun, 2011]. Показано, что у больных ИБС, особенно в сочетании с диабетом 2 типа, снижена способность клеток костного мозга формировать колонии, пролиферировать, мигрировать, стимулировать неоваскуляризацию ишемизированной конечности у иммунодефицитных мышей [Pittenger, 2004]. Значительное снижение функциональной активности предшественников эндотелиальных клеток и мезенхимальных клеток костного мозга показано у