Иммуногенные конструкции на основе фрагментов оболочечного белка E2 вируса гепатита C

• Автор: Мойса, Александр Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 160 с. : ил.

Список сокращений

АФ - адъювант Фрейнда ВГС - вирус гепатита С

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГС - гепарансульфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ОАС - олигоаденилатсинтетаза

ОРТ - открытая рамка трансляции

ТМД - трансмембранный домен

ABTS - 2,2"-азино-бис(3-этилбензиазолин-6-сульфокислота)
ADAR - (RNA-specific adenosine deaminase) РНК-специфичная аденозиндезаминаза
ARFP - (alternate reading frame protein) альтернативная рамка считывания ASGP-R - асиалогликопротеиновый рецептор CLDN - белки плотных контактов - клаудины DMF - N, N-диметилформамид
ESI ORBITRAP MS и MS/MS - масс-спектрометрия (простая и тандемная) с ионизацией электрораспылением и детекцией с помощью орбитальной ионной ловушки.
elF - (eukaryotic initiation factor) фактор инициации трансляции GTP - гуанозин-5'-трифосфат
HLA - (Human leucocyte antigen) Человеческий лейкоцитарный антиген HVR1 - гипервариабельный регион I IFN - интерферон IL - интерлейкин
IRES - внутренний сайт связывания рибосом
IRF - интерферон-регулирующий фактор
МНС - (Major histocompatibility complex) главныii комплекс
гистосовместимости
MALDI-TOF - matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight времяпролетная [масс-спектрометрия] с лазерной десорбцией-ионизацией с помощью матрицы NTR - нетранслируемый участок
PRR- (pattern recognition receptor) образ-распознающий рецептор TNF - фактор некроза опухоли TLR толл-подобный рецептор
Оглавление
1 Введение
2 Обзор литературы
2.1 Строение генома и организация вирусной частицы гепатита С
2.2 Жизненный цикл вируса гепатита С
2.2.1 Рецепция ВГС клетками печени
2.2.2 Проникновение ВГС в клетку-мишень и высвобождение в цитоплазму генетического материала
2.2.3 Трансляция РНК и пост-трансляционный процессинг полипротеина
2.2.4 Репликативный комплекс ВГС, механизм репликации
2.2.5 Сборка вириона ВГС
2.3 Иммунный ответ на ВГС
2.3.1 Взаимодействие ВГС с молекулярными компонентами неспецифического антивирусного ответа (иммунитета)
2.3.2 Взаимодействие ВГС с клеточными компонентами неспецифического иммунитета
2.3.3 Специфический противовирусный иммунитет при ВГС инфекции.
2.4 Экспериментальные модели ВГС-ннфекции
2.4.1 Репликация ВГС в клеточных линиях
2.4.2 Модели ВГС-инфекции на животных
2.5 Вакцины против гепатита С
2.5.1 Что такое пептидные вакцины и в чём их преимущества?
2.5.2 Этапы создания синтетической пептидной вакцины
2.5.3 Выбор антигенных детерминант для иммуногенной конструкции..
2.5.4 Конструирование пептидного иммуногена
2.5.5 Синтез иммуногена
2.5.6 Адъюванты для пептидных вакцин
2.5.7 Оценка эффективности и протективности иммунного ответа на синтетические пептидные пммуногены
2.5.8 Синтетические пептидные вакцины против гепатита С
3 Материалы и методы
3.1 Химические реагенты и биологические препараты
3.2 Растворители
3.3 Оборудование и программное обеспечение
3.4 Автоматический синтез пептидов-иммуногенных конструкций на
твердофазном носителе
3.5 Ручной синтез модельных пептидов на иглах
3.6 Образование дисульфидных связей в пептидах
3.7 Характеристика и очистка пептидов
3.8 Масс-спектрометрический анализ
3.9 Определение диаметра частиц иммуногенных конструкций
3.10 Ультрафильтрация
3.11 Получение сывороток крови от иммунизированных животных
3.12 Получение препаратов 1§в из антисывороток животных
3.13 Тестирование сывороток методом иммуноферментного анализа
3.13.1 ИФА с использованием в качестве антигена синтетических
пептидов
3.13.2 ИФА с использованием в качестве антигена синтетических
биотинилированных пептидов
3.13.3 ИФА с использованием в качестве антигена оболочечного белка
Е2 или гетеродимера Е1Е
3.14 Тестирование препаратов на способность взаимодействия с
вирусными частицами из плазмы крови больных гепатитом С
3.14.1 Выделение тотальной РИК
3.14.2 Проведение реакции обратной транскрипции
3.14.3 Проведение полимеразной цепной реакции

реконвалесцентов от гепатита С [Gerlach et al., 2005]. Доминантные Th-эпитопы также обнаружены в кор-белке и белке NS4 [Gerlach et al., 2005; Nasser et al., 2007; Smyk-Pearson et al., 2008].
Широкомасштабные исследования по выявлению Т-хелперных эпитопов, специфичных для 52 выздоровевших от гепатита С пациентов, при помощи 393 15-членных перекрывающихся пептидов из консервативных участков белков ВГС показали, что специфичность Т-хелперного ответа на белки ВГС в человеческой популяции может быть весьма гетерогенной [Klade et al., 2009]. Из 38 пептидов, проявлявших Т-эпитопную активность, только 5 вызывали Т-клеточный ответ более чем у двух человек. Интенсивность ответа также варьировала у разных пациентов. В этом же исследовании впервые были выявлены Т-хелперные эпитопы в составе консервативных участков белка Е2: (№№ аминокислотных остатков) LEDRDRSELSPLLLSTTEW;
V CGPVYCFTPSPVVVGTTDR; DYPYRLWHYPCTVNYTIFKI;
GLIHLHQNIVDVQYL; DQRPYCWHYAPRPCG; TCPTDCFRKHPEATY; YTKCGSGPWLTPRCL; LNAACN WTRGERCDL.
2.4 Экспериментальные модели ВГС-ннфекции
2.4.1 Репликация ВГС в клеточных линиях
До недавнего времени одной из проблем, тормозившей исследования жизненного цикла ВГС, патогенеза гепатита С и разработку противовирусных агентов, включая вакцины, было отсутствие адекватных лабораторных моделей ВГС-инфекции. Единственной моделью ВГС-инфекции на уровне организма был гепатит С у шимпанзе (единственного, кроме человека, животного, восприимчивого к этой инфекции), вызванный инокуляцией изолята ВГС от больного человека [Yanagi et al., 1997]. Эта модель чрезвычайно дорогая; кроме того, при работе с ней возникают этические проблемы. Исследование ВГС-инфекции на клеточном уровне также было затруднено: долго не удавалось добиться эффективной репликации ВГС в культуре клеток. В 2005 г. в этой области произошёл прорыв - японским исследователям удалось выделить от