Поиск и идентификация потенциальных биомаркеров рака яичников в сыворотке крови человека

• Автор: Арапиди, Георгий Павлович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 146 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Цели и задачи исследования
Научная новизна работы
Теоретическая и практическая значимость работы
Апробация работы
Личный вклад автора
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1. Рак яичников
1.1. Злокачественные новообразования
1.2.Рак яичников
1.3. Современные методы диагностики рака яичников
2. Протеомные технологии для поиска новых маркеров онкологических заболеваний
2.1. Протеомика и пептидомика
2.2. Масс-спектрометрия - основной инструментальный метод протеомики
2.2.1. Методы ионизации биологических макромолекул
2.2.2. Основные типы масс-анализаторов
2.2.3. Тандемная масс-спектрометрия
2.2.4. ЬС-МБ/МБ - тандемная масс-спектрометрия, сопряженная с высокоэффективной жидкостной хроматографией
2.2.5. Методы количественного масс-спектрометрического анализа
2.3. Биоинформатические подходы в протеомике
2.3.1 Построение математических моделей классификации
2.3.2 Идентификация пептидов и валидация результатов идентификации
2.4 Кровь, как объект биомаркерных исследований
2.4.1 Плазма и сыворотка крови
2.4.2. Гипотеза образования пептидных биомаркеров
2.4.3. Основные сложности протеомных и пептидомных исследований производных крови
2.4.4. Методы выделения пептидов из плазмы/сыворотки крови
2.4.4.1. Ультрафильтрация
2.4.4.2. Преципитация белков органическими растворителями
2.4.4.3. Твердофазная экстракция
2.4.4.4. Выделение пептидов на хроматографических сорбентах с ограниченным доступом к сорбционным центрам
2.4.4.5 Деплеция основных белков плазмы/сыворотки крови
2.4.5 Методы десорбции пептидов с поверхности основных белков
плазмы крови
2.4.6. Использование масс-спектрометрии для поиска в плазме и сыворотке крови потенциальных маркеров онкологических заболеваний
2.4.7. Современные достижения в области поиска белковых/пептидных биомаркеров рака яичников
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Образцы сыворотки крови
2. МАЛДИ МС профилирование сыворотки крови
2.1 Фракционирование образцов сыворотки крови
2.1.1 Протокол фракционирования с использованием МВ-ШСХ
2.1.2 Протокол фракционирования с использованием МВ-Н1С 8 (18)
2.1.3 Протокол фракционирования с использованием МВ-1МАС Си
2.2. Стадия прогревания элюатов образцов сыворотки крови
2.3. МАЛДИ масс-спектрометрическое оборудование
2.4. Анализ масс-спектрометрических данных
3. Идентификация потенциальных пептидных биомаркеров

m'Z£^
3.1 Фракционирование образцов сыворотки крови
3.1.1 Протокол фракционирования с использованием MB-WCX
3.2 Стадия прогревания элюатов образцов сыворотки крови
3.3 Обессоливание на микроколонках с обращено фазовой поверхностью.
3.3.1 Протокол фракционироваши на микроколонках с обращено фазовой поверхностью
3.4 Масс-спектрометрическое оборудование
3.5 Идентификация пептидов и биоинформатический анализ
4. Количественный анализ содержания пептидов в сыворотке крови методом
SWATH
4.1 Масс-спектрометрическое оборудование
4.2 Биоинформатический анализ данных SWATH
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Метод выделения пептидов из сыворотки крови человека
1.1 Сравнение пептидного и белкового состава элюатов до и после прогревания
1.2 Прогревание белка Apolipoprotein А-I
2. Построение классификационных моделей
2.1 Фракционирование образцов сыворотки крови с использованием различных типов магнитных микрочастиц
2.2 Построение классификационных моделей на основе профилирования на магнитных микрочастицах MB-WCX
2.3 Построение классификационных моделей сравнения групп «рак яичников» и «номинальный контроль»
2.4 Влияние длительности инкубации крови до получения сыворотки на последующий масс-спектрометрический профиль
3. Идентификация потенциальных биомаркеров рака яичников
4. Анализ потенциальных биомаркеров количественным безметочным масс-спектрометрическим методом SWATH

часто архивируемых биологических объектов. Использование этих готовых коллекций при проработанной методике пробоподготовки позволяет проводить на основе сыворотки крови биомаркерпые исследования за относительно короткие сроки [137]. Кроме того, пептидный и белковый составы сыворотки после отделения от форменных тел крови считаются стабильными [54, 150]. К недостаткам сыворотки крови как объекта исследования относят процесс образование пептидов при свертывании крови, который зависит от многих трудно контролируемых факторов [49, 137]. Известно, что к основным факторам, влияющим на пептидный состав сыворотки крови, относятся тип используемых при заборе крови вакутейнеров, уровень гемолиза эритроцитов и время инкубации крови до отделения сыворотки от сгустка форменных элементов центрифугированием [54, 146]. Тем не менее, большинство исследователей продолжает использовать в своих работах сыворотку крови. Рекомендуемые протоколы получения сыворотки крови включают инкубацию при комнатной температуре в течение 60 минут [146]. После формирования сгустка и до его отделения от сыворотки центрифугированием возможна инкубация или транспортировка на льду длительностью до 3 часов [54]. Аликвоты сыворотки крови рекомендуют хранить при -80°С. Среди исследователей нет единого мнения по вопросу сохраняется ли стабильность белкового профиля сыворотки крови при многократном повторении циклов заморозки и последующей разморозки образцов [54, 146].
2.4.2. Гипотеза образования пептидных биомаркеров
Термин «биомаркер» был определен следующим образом: параметр, который может быть измерен, чтобы отличить нормальный биологический процесс от патологического процесса или определить фармакологический ответ на введение лекарства (NIH Biomarker Definition Working Group) [152].
Опухоль следует рассматривать в условиях её микроокружения [56, 60]. Взаимодействия опухолевых клеток со здоровыми эпителиальными и стромальнымн клетками, с сосудами капилляров и с иммунной системой