Роль кальдесмона в миграции немышечных клеток

• Автор: Кудряшова, Татьяна Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Направленная миграция немышечных клеток
1.1. Связывание хемоагтрактанта с рецептором и поляризация клетки
1.2. Внутриклеточная передача сигнала от активированного
хеморецептора к цитоскелету
1.3. Формирование псевдоподий на переднем крае
1.4. Закрепление новосформированных протрузий
1.5. Перемещение тела клетки и подтягивание хвостовой части клетки
2. Структура и регуляция основных белков двигательного аппарата клетки
2.1. Немышечный актин
2.1.1. Структура мономерного немышечного актина
2.1.2. Образование актиновых филаментов
2.1.3. Роль малых ГТФаз семейства Rho в регуляции
полимеризации актиновых филаментов
2.2. Немышечный миозин
2.2.1. Структура немышечного миозина
2.2.2. Структура стресс-фибрилл
2.3. Кальдесмон
2.3.1. Локализация, изоформы
2.3.2. Доменная организация кальдесмона
2.3.3. С - концевой домен кальдесмона (Н22 фрагмент) -
функциональный аналог целого белка
2.3.4. Фосфорилирование и регуляция свойств кальдесмона МАР-киназами
2.3.5. Участие кальдесмона в регуляции цитоскелета и миграции клеток
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
1. Биохимические и молекулярно - биологические методы
1.1. Определение концентрации белка
1.1.1. Спектрофотометрический метод
1.1.2. Определение концентрации белка по методу Шаффнера и Вайсмана
1.2. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН - электрофорез)
1.3. Иммуноблоттинг

1.4. Электрофорез в присутствии мочевины и глицерола
1.5. Приготовление образцов клеток для ДСП - электрофореза
1.6. Выделение гропомиозина из мускульных желудков курицы
1.7. Выделение актина
1.8. Выделение тяжелого меромиозина
1.9. Экспрессия рекомбинантных белков в бактериальной системе
1.9.1. Трансформация бактериальных клеток
1.9.2. Тестовая экспрессия рекомбинантных белков
1.9.3. Препаративная экспрессия рекомбинантных белков
1.10. Экспрессия и очистка рекомбинантного фрагмента кальдесмона Н
и его мутированных форм H22S759A и H22S789A
1.11. Экспрессия и очистка GST-p44erkl МАР-киназы
1.12. Фосфорилирование белков in vitro
1.12.1. Фосфорилирование рекомбинантных фрагментов Н22 кальдесмона MAP-киназой in vitro
1.12.2. Фосфорилирование ТММ киназой легких цепей миозина in vitro
1.13. Определение скорости актин-активируемой Mg-АТФазы тяжелого меромиозина и актин-связывающей способности фрагмента кальдесмона
1.14. Определение неорганического фосфата
1.15. Коседиментационный анализ связывания фрагментов кальдесмона
с КаМ - сефарозой
2. Клегочно - биологические методы
2.1. Культивирование клеток линии HeLa 1469 и фибробластов линии NIH ЗТЗ
2.2. Подавление экспрессии кальдесмона в немышечных клетках
методом РНК - интерференции
2.2.1. Подавление экспрессии кальдесмона в клетках HeLa 1
2.2.2. Подавление экспрессии кальдесмона в клетках NIH ЗТЗ
2.3. Измерение подвижности клеток методом зарастания
экспериментальной раны в клеточном монослое
2.3.1. Прижизненная регистрация ламеллиподии клеток
2.3.2. Измерение средней скорости движения клеток
2.4. Измерение хемотаксиса клеток в камере Бойдсна
2.5. Измерение адгезии клеток
2.6. Измерение скорости деадгезии клеток
2.7. Измерение скорости роста культуры клеток
2.8. Индукция образования актиновых стресс-фибрилл
2.9. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток
3. Количественная обработка изображений и статистический анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Изучение индивидуальной роли фосфорилирования остатков

Сер ‘ и Сер кальдесмона р42/44 MAP-киназой на его свойства in vitro
1.1. Фосфорилирование MAP-киназой ухудшает
актин-связывающие свойства кальдесмона
1.2. Способность кальдесмона ингибировать АТФазу актомиозина
ослабляется при фюсфорилировании МАР-киназой
1.3. Влияние индивидуального фосфорилирования кальдесмона
МАР-киназой на его взаимодействие с кальмодулином
2. Разработка экспериментальных клеточных моделей для выяснения
роли кальдесмона в миграции
3. Влияние кальдесмона на миграцию клеток
3.1. Кальдесмон ингибирует миграцию NIH ЗТЗ фибробластов
3.2. PDGF - стимулированная миграция фибробластов
не зависит от фосфорилирования кальдесмона по остатку Сер
3.3. Кальдесмон ингибирует хемотаксис клеток HeLa 1
3.4. Кальдесмон ингибирует миграцию клеток HeLa 1
3.5. Кальдесмон участвуете регуляции динамики ламеллиподии
и ее актинового цитоскелета
3.5.1. Кальдесмон стабилизирует ламеллиподию мигрирующих
клеток IleLa 1
3.5.2. Кальдесмон способствует поддержанию пучков микрофиламентов в
зоне ламеллиподии и повышает уровень полимерного актина
3.6. Кальдесмон не регулирует адгезивные свойства клеток HeLa 1
3.6.1. Снижение экспрессии кальдесмона не влияет на распределение
винкулина в ламеллиподии мигрирующих клеток HeLa 1
3.6.2. Кальдесмон не регулирует адгезивные свойства клеток HeLa 1469..
3.7. Кальдесмон участвует в формировании стресс-фибрилл
в клетках в покое и при стимуляции сывороткой
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

вызывает переход миозина из 10S в 6S конформацию, приводя к полимеризации миозина даже если его РЛЦ не фосфорилированы [Katayama et al., 1995; Kudryashov et al., 2002]. Учитывая, что взаимодействие миозина с актиновыми филаментами в значительной степени влияет на сборку стресс-фибрилл, кальдесмон может регулировать сократимость клетки двумя путями, регулируя сборку как актиновых, так и миозиновых филаментов.
Кроме структурной функции, актин-связывающие белки тропомиозин, кальдесмон и, возможно, кальпонин, могут прямо регулировать сократимость стресс-фибрилл, влияя на моторную активность актом иозина. Как уже было отмечено, фосфорилирование Ser19 РЛЦ значительно стимулирует актин-активируемую АТФазу миозина II, которая и обеспечивает моторную функцию актомиозинового комплекса. Кальдесмон и тропомиозин регулируют взаимодействие миозина с актином по общему для гладкомышечных и немышечных клеток механизму [Clark, 1986; Marston and El-Mezgueldi, 2008]. При помощи биосенсора активного (фосфорилированного) миозина II было показано, что в движущемся фибробласте.миозин II существенно более фосфорилирован, а следовательно, и активирован, в хвостовой части клетки, а слабее всего — в зоне лидирующего края [Post et al., 1995]. Поэтому можно предполагать, что регуляторное воздействие кальдесмона и тропомиозина на АТФазу актомиозина будет проявляться, в основном, в сократительных процессах, протекающих в хвостовой части клетки.
2.2.2. Структура стресс-фибрилл
Так же как и микрофиламенты актина, миозиновые филаменты расположены в стресс-фибриллах полярно и движение миозинового мотора направлено от минус-конца к плюс-концу микрофиламента [Deguchi and Sato, 2009]. Поскольку стресс-фибриллы несут разноправленные индивидуальные микрофиламенты, прикрепленные через фокальные комплексы к мембране клетки, активация актомиозина приводит к укорачиванию стресс-фибрилл и стягиванию разных частей клетки. Жесткость стресс-фибрилл обеспечивается в клетке актин-связывающими белками-регуляторами (тропомиозином, кальдесмоном и др.), которые декорируют акгиновые филаменты и повышают их устойчивость.
Фибриллярный белок тропомиозин представляет себой суперспирализованный димер а-спирального белка длиной 40 нм. Он располагается в желобке актиновой нити так, что одна молекула тропомиозина взаимодействует с 7 мономерами актина [Lehman and Craig, 2008]. Взаимодействуя конец-в-конец, соседние молекулы тропомиозина образуют непрерывную нить вдоль всего микрофиламента [Lehman et al., 1996]. В немышечных клетках тропомиозин стабилизирует актиновые филаменты от действия разрезающих белков в зоне ламеллиподии [Wang and Coluccio, 2010].