Получение и характеристика мультиферментных комплексов карбогидраз и исследование их эффективности при осахаривании различных видов целлюлозосодержащих материалов

• Автор: Осипов, Дмитрий Олегович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

Г лава 1. Источники целлюлозосодержащего сырья и его состав

Глава 2. Состав, строение и основные свойства компонентов растительной

клеточной стенки

2.2. Целлюлоза

2.2. Гемицеллюлозы

2.3. Пектины и лигнин

Глава 3. Ферментативная деградация целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ)

3.1. Общие сведения о гликозил-гидролазах, участвующих в гидролизе ЦСМ
3.2. Целлюлазы
3.3. Гемицеллюлазы
3.4. Механизм действия целлюлазного комплекса
3.5. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы
Глава 4. Штамм Pénicillium verruculosum и компоненты секретируемого им ферментного комплекса
Экспериментальная часть
Глава 5. Объекты исследования и методы экспериментов
5.1. Ферментные препараты
5.2. Субстраты
5.3. Прочие реактивы
5.4. Хроматографические сорбенты
5.5. Проведение полимеразной цепной реакции и получение генетических конструкций
5.6. Окрашивание агаризованной среды с аморфной целлюлозой конго красным
5.7. Культивирование трансформантов P. verruculosum в 3-л ферментерах

5.8. Метод определения концентрации белка
5.9. Методы определение биохимических характеристик ферментов
5.10. Методы определения активности ферментов
5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков
5.12. Определение температурного и pH-оптимума действия ферментных препаратов
5.13. Изучение термо- и pH-стабильности ферментных препаратов
5.14. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов
гидролиза целлюлозосодержащего сырья
5.15. Хроматографическое фракционирование препаратов Р. verrnculosum
5.16. Гидролиз целлюлозосодержащих материалов
Результаты и их обсуждение
Глава 6. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Р. vetruculosum
6.1. Выделение генов и создание экспрессионных конструкций
6.2. Трансформация штамма-реципиента Р. verruculosum 537
6.3. Первичный скрининг полученных трансформантов
6.3.1. Первичный скрининг трансформантов, содержащих гетерологичные целлюлазы
6.3.2. Первичный скрининг трансформантов, содержащих гетерологичные гемицеллюлазы
6.4. Получение рекомбинантных ферментных препаратов
Глава 7. Физико-химические свойства новых ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов Р. verruculosum
7.1. Анализ ферментных препаратов с помощью методов электрофореза и изоэлектрофокусирования

7.2. Активность ферментных препаратов по отношению к различным субстратам
7.3. pH- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, стабильность ферментных препаратов
Глава 8. Гидролиз полисахаридных субстратов лабораторными мультиферментными препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов Р. уеггиси1ояит
8.1. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины
8.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины
8.2. Результаты гидролиза измельченной багассы
8.4. Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы (МКЦ)
8.5. Сравнение эффективности гидролиза растительных субстратов ферментными препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов Р. х'еггисикжит
и коммерческими ферментными препаратами
8.6. Влияние pH и температуры на эффективность гидролиза ЦСМ
Глава 9. Состав рекомбинантных ферментных препаратов
Выводы
Список литературы

эндоглюканаз (в гораздо меньшем количестве, чем целлобиоза) гидролизуются в растворе до глюкозы Р-глюкозидазой.

Рисунок 6. Схематичное представление механизма ферментативного гидролиза целлюлозы под действием эндоглюканаз и целлобиогидролаз (по данным [143]). НВ и В
- невосстанавливающие и восстанавливающие концы молекул целлюлозы,
соответственно.
В действительности, ферментативный гидролиз целлюлозы протекает по более сложному механизму. Например, на рис.6 не показано возможное диспергирующее действие ЦСД на кристаллическую целлюлозу по негидролитическому типу. Более того, сообщается, что целлобиогидролаза СеІбА Н. ітоіет обладает способностью к эндо- и экзодействию [60], а значит, разделение целлюлаз по этому признаку не является вполне удовлетворительным. Схемы, иллюстрирующие механизм действия целлюлазного комплекса целлюлосомального типа, приведены в обзоре [164].
3.5. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы
К факторам, влияющим на эффективность гидролиза ЦСМ, относятся качественный и количественный состав ферментного комплекса, ингибирование продуктами реакции, условия гидролиза, инактивация ферментов, уменьшение реакционной способности субстрата в ходе гидролиза, присутствие в реакционной среде ПАВ и ПЭГ. Часто эти факторы взаимосвязаны, и их роли в процессе трудно разделить [165,166].
Условия гидролиза: концентрация субстрата, pH, ионная сила, температура, перемешивание - значительно влияют на эффективность гидролиза. Можно влиять на