Новый эффективный подход для получения рекомбинантных белков основного фактора роста фибробластов (FGF-2) и лиганд-связывающего внеклеточного домена рецептора II типа TGF-β (TβRII-ED) в E. coli

• Автор: Елистратов, Павел Алексеевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил.

Содержание
Содержание
Список используемых сокращений
1. Введение
2. Цели и задачи работы
3. Литературный обзор
3.1. Общая характеристика факторов роста
3.2. Основной фактор роста фибробластов РОР-
3.2.1. Общая характеристика РОР-
3.2.2. Взаимодействие РОР-2 с рецепторами
3.2.3. Изоформы РОР-
3.2.4. Структура РОР-
3.2.5. Биологическая активность и функции РОР-
3.3. Трансформирующий фактор роста (31 (ТОР-рі) и его рецептор типа II (ТрМІ)
3.3.1. Суперсемейство белков ТОР-рі
3.3.2. Структура ТОР-рі
3.3.3. Рецепторы и механизмы внутриклеточных сигнальных путей
ТОР-Р
3.3.4. Биологическая активность и функции ТОБ-рІ
3.4. Экспрессия и ренатурация рекомбинантных белков
3.4.1. Слитные рекомбинантные белки
3.4.2. Экспрессия рекомбинантных белков
3.4.3. Расщепление слитных белков
3.4.4. Ренатурация рекомбинантных белков
4. Материалы и методы
4.1. Материалы
4.2. Методы

4.2.1. Конструирование плазмидной ДНК
4.2.2. Сайт-направленный мутагенез
4.2.3. PIPES-трансформация, приготовление компетентных клеток E.coli штамма XL-1 Blue
4.2.4. Получение компетентных клеток E.coli BL21(DE3)
4.2.5. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК
4.2.6. Выделение плазмидной ДНК
4.2.7. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
4.2.8. Определение концентрации белка в растворе
4.2.9. Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном

4.2.10. Экспрессия белка FGF-2 и его мутантного варианта и белка
T|3RII
4.2.11. Очистка и расщепление белка FGF-
4.2.12. Идентификация белков по N-концевой последовательности
4.2.13. Метод оценки жизнеспособности клеток с метилтиазолтетразолием (МТТ-тест)
4.2.14. Очистка, ренатурация и расщепление белка TpRII-ED
4.2.15. Очистка TpRII-ED с помощью метода обратнофазной HPLC хроматографии
4.2.16. MALDI-TOF масс-спектрометрия
4.2.17. Метод спектроскопии кругового дихроизма
4.2.18. *Н ЯМР-спектроскопия
4.2.19. Исследование связывания белка-рецептора TpRII-ED с лигандом TGF-pi методом ELISA
5. Результаты и обсуждение
5.1. Синтез генов FGF-2 и TpRII-ED и клонирование их в экспрессионные векторы
5.2. Экспрессия слитного белка Trx/FGF2 в E.coli
5.3. Очистка слитного белка Trx/FGF-

5.4. Расщепление слитного белка Trx/FGF-2 энтеропептидазой и очистка целевого белка FGF-
5.5. Исследование физико-химических свойств полученного рекомбинантного белка FGF-
5.6. Введение C78S и C96S мутаций в ген FGF-2 и получение экспрессирующего вектора pET32a/FGF-2/C78S/C96S
5.7. Экспрессия и очистка мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S
5.8. Проверка биологической активности очищенного препарата FGF-2 и его мутантного варианта FGF-2/C78S/C96S на культуре клеток
5.9. Преимущества разработанной методики получения и очистки рекомбинантного FGF-
5.10. Экспрессия слитного белка Trx/TßRII-ED в E.coli
5.11. Очистка и расщепление слитного белка Trx/TßRII-ED энтеропептидазой и очистка целевого белка TßRII-ED
5.12. Исследование физико-химических свойств полученного рекомбинантного белка TßRII-ED
5.13. Исследование связывания белка-рецептора TßRII-ED с лигандом TGF-ßl методом ELISА
5.14. Преимущества разработанной методики получения и очистки рекомбинантного белка-рецептора TßRII-ED
6. Выводы
7. Список литературы

Рекомбинантный белок FGF-2 продается различными иностранными компаниями. Однако высокая стоимость затрудняет его широкое применение в клинических исследованиях. Разработанные нами методики экспрессии и очистки рекомбинантного белка FGF-2 позволяют получить высокоочищенный, высокоактивный и стабильный препарат. Высокие выходы (примерно 100мг с 1 литра культуры клеток) и низкая стоимость препарата делают его доступным терапевтическим средством для доклинических и клинических испытаний, а также для лечения ран различного происхождения.
3.3. Трансформирующий фактор роста р (TGF-P) и его рецептор типа II (ТРИП)
3.3.1. Суперсемейство белков TGF-P
TGF-P был обнаружен из-за его способности к «трансформации» фибробластов крысы учеными, которые занимались исследованием фактора роста тромбоцитов (PDGF) и эпидермального фактора роста (EGF) в 1983 (Anzano и др., 1983; Roberts и др., 1983). Первоначально его назвали фактором роста саркомы (SGF), а позже выяснили, что существует два отличных друг от друга фактора: TGF-a и TGF-p. TGF-P принадлежит к большой семье структурно и функционально связанных между собой белков, которых известно более 40 представителей, каждый из членов которой регулирует широкий спектр клеточных ответов, включая пролиферацию, дифференцировку, адгезивные свойства, перемещение и апоптоз клеток (Wharton и др., 2009; Letterio и др., 1998; Massague, 1998). Все эти процессы важны для развития ткани и поддержания гомеостаза в организме. Суперсемейство TGF-P условно делят на несколько основных семейств (Рис. 9) (Chin и др., 2004). Собственно трансформирующий фактор роста относится к семейству TGF-p, оно включает пять изоформ-полипептидов: TGF-pl, TGF-P2 и TGF-P3, экспрессирующие у
млекопитающих, TGF-P4, встречающийся у птиц, и TGF-P5 - у амфибий. У