Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток

• Автор: Емельянов, Максим Олегович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Оглавление.
Введение

1. Обзор литературы

1.1. Окислительный стресс

1.1.1. Понятие окислительного стресса

1.1.2. Активные формы кислорода

1.1.2.1. Общее понятие активных форм кислорода

1.1.2.2. Супероксидный анион-радикал

1.1.2.3. Пергидроксильный радикал

1.1.2.4. Перекись водорода

1.1.2.5. Гидроксильный радикал

1.1.2.6. Синглетный кислород
1.1.2.7. Гипохлорид
1.1.2.8. Оксид азота
1.1.2.9. Пероксинитрит
1.1.3. Источники активных форм кислорода
1.1.3.1 Метаболические пути образования АФК
1.1.3.2. Образования АФК митохондриями во время гипоксии и гипероксии
1.1.3.3. Образования АФК при действии ионизирующего облучения
1.1.4. Роль АФК
ПАЛ. Клеточная сигнализация
1.1.4.2. Экспрессия генов
1.1.4.3. Регуляция клеточной гибели
1.1.4.4. Регуляция клеточного роста
1,2.Методы определения окислительного стресса в клетках
1.2.1. Определение супероксидного аниона-радикала
1.2.2. Детекция перекиси водорода
1.2.3. Детекция пероксинитрита

1.2.4. Использование флуоресцентного красителя 2’,7’-дихлорофлуоресцеина
1.3. Множественная лекарственная устойчивость
1.3.1. Неклеточные механизмы устойчивости
1.3.2. Клеточные формы устойчивости
1.3.3. Природная устойчивость
1.3.4. Приобретенная устойчивость
1.3.4.1. Роль ключевых генов, контролирующих апоптоз, в развитии лекарственной устойчивости
1.3.4.2. Транспортные белки, ответственные за множественную лекарственную устойчивость
1.3.4.2.1. Структура Р-гликопротеина
1.3.4.2.2. Конформационные изменения структуры P-gp
1.3.4.2.3. Субстратная специфичность P-gp
1.3.4.2.4. Ген mdrl, кодирующий Р-гликопротеин, генетические механизмы P-gp-МЛУ
1.3.4.'2.5. Экспрессия mdrl в нормальных тканях и клетках
1.3.4.2.6. Роль МЛУ, опосредованной P-gp, в злокачественных новообразованиях
1.3.4.2.7. MRP, белок, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивости
1.3.4.2.8. Ингибиторы транспортных белков МЛУ
1.3.5. Регуляция МЛУ
1.3.5.1. Влияние цитокинов на МЛУ
1.3.5.2. Роль фосфолипазы С и протеинкиназы С в регуляции МЛУ
1.3.5.3. Роль МАРК каскада в МЛУ
1.3.5.4. Факторы транскрипции, регулирующие МЛУ
1.3.5.5. Влияние окислительного стресса на экспрессию генов и синтез белков, ответственных за МЛУ
2. Материалы и методы
2.1. Реактивы и среды
2.2 Определение количества клеток в опухоли
2.3. Облучение клеток
2.4. Культуры клеток. Определение выживаемости клеток
2.4.1. Клетки Р388 и P388VR. Определение влияния винкристина и перекиси водорода на выживаемость клеток
2.4.2. Клетки НЕр-2. Определение влияния винкристина и облучения на выживаемость клеток
2.5. Определение АФК
2.5.1. Определение АФК в клетках Р388 и P388VR
2.5.2. Определение АФК в клетках НЕр-
2.6. Определение активности транспортных белков
2.6.1. В клетках НЕр-
2.6.2. В клетках P388VR
2.7. Статистический анализ
3. Результаты
3.1. Разработка нового метода определения АФК по количеству образовавшегося в клетках DCF
3.2. Определение АФК в клетках в различных условиях
3.2.1. Влияние на АФК в клетках in vitro состава среды, концентрации клеток, перекиси водорода
3.2.2 Влияние ионизирующей радиации на АФК в клетках
3.3. Влияние окислительного стресса на МЛУ клеток лимфолейкоза P388VR
3.3.1. Изменение МЛУ при росте клеток in vivo
3.3.2. Влияние перекиси водорода на МЛУ
3.4. Влияние ионизирующей радиации на МЛУ клеток НЕр-
3.4.1. Влияние радиации на МЛУ. Зависимость от дозы, концентрации
клеток и времени после облучения
4. Заключение

в исследовании продукции супероксида ну уровне клетки и ткани. Реакция NO с эндогенным гемом и негемовым железом приводит к образованию железо-нитрозильного комплекса с характерным спектром. Добавление экзогенных железо-дитиокарбаматов и nitronyl nitroxides также используется для детекции образования N0. Обе активные формы кислорода и оксид азота обнаруживаются in vivo с помощью ЭПР. Не смотря на нестабильность, тканевый метаболизм, иногда широкую активность спиновых ловушек и цену ЭПР-спектроскопии, при комбинации этой методики с другими, ЭПР очень полезна для детекции активных форм кислорода (Тагреу, М.М., Fridovich, I., 2001).
Ингибирование аконитазы. Фермент аконитаза представлен как в цитоплазме клетки, так и в митохондрии. Его роль — превращение цитрата в изоцитрат. Аконитаза обратимо ингибируется супероксидом, который ,окисляя, удаляет атом железа из активного центра фермента [4Fe-4S] (Flint D.H. et al., 1993; Hausladen A., Fridovich I., 1994; Castro L. et al., 1994). В целом, в клетке фермент постоянно подвергается действию супероксид-аниона, но так как его действие обратимо, то поддерживается равное соотношение активной и неактивной аконитазы. Это соотношение начинает смещаться в сторону неактивной формы при эндогенном добавлении окислителя или же при его гиперпродукции внутри клетки. Это дает возможность оценить количество супероксида по активности аконитазы. Изменение активности фермента наблюдают спектрофотометрически по реакции превращения изоцитрата в цис-аконитат при 240 нм (Gardner P.R., Fridovich I., 1992; Gardner P.R. et al., 1995; Hausladen A., Fridovich I., 1996). Проблема данной методики заключается в чувствительности, так как наличие другого окислителя может исказить полученные данные об активности фермента. В роли этих окислителей могут выступать пероксинитрит и N0. Кислород и перекись водорода тоже способны ингибировать аконитазу, но константа скорости реакции оксиления относительно супероксида довольно мала (Тагреу, М.М., Fridovich, I., 2001).