Биохимические и иммунохимические свойства натрийуретического пептида В-типа и его предшественника

• Автор: Тамм, Наталья Никитична
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 155 с. : ил.

Оглавление

Список используемых сокращений

Введение

2 Обзор литературы

2.1 Натрийуретические пептиды

2.1.1 Семейство натрийуретических пептидов. История открытия

2.1.2 Строение натрийуретических пептидов

2.2 Натрийуретический пептид В-типа

2.2.1 Регуляция синтеза BNP

2.2.2 Синтез и секреция BNP

2.3 Строение и функционирование рецепторов натрийуретических пептидов

2.3.1 Активация рецепторов А-типа
2.4 Физиологическое действие BNP
2.4.1 Действие НП на сердечнососудистую систему
2.4.2 Действие BNP па эндокринную систему
2.4.3 Действие НП на работу почек
2.4.4 Действие натрийуретических пептидов в легких
2.4.5 Фиброз и гипертрофия сердечной ткани
2.5 Молекулярные формы BNP в крови
2.5.1 N-концевой фрагмент предшественника BNP
2.5.2 Пост-трансляционные модификации молекулы предшественника BNP
2.5.3 Пост-трансляционные модификации молекулы NT-proBNP
2.6 Инактивация натрийуретического пептида В-типа и его предшественника
2.7 Формы BNP, проявляющие физиологическую активность
2.8 Сердечная недостаточность
2.8.1 Классификация сердечной недостаточности
2.8.2 Эпидемиология сердечной недостаточности
2.8.3 Биохимические аспекты патогенеза сердечной недостаточности
2.8.4 Использование натрийуретических пептидов для диагностики сердечной недостаточности
2.8.5 Количественное определение BNP в диагностике острой сердечной недостаточности
2.8.6 Диагностика бессимптомной дисфункции левого желудочка
2.8.7 Неспецифические изменения концентрации BNP (NT-proBNP)
2.8.8 Использование BNP в оценке прогноза выживаемости
2.8.9 Определение BNP (NT-proBNP) для оценки эффективности терапии СН
2.8.10 Использование BNP в терапии СН
2.8.11 Пороговые концентрации BNP и NT-proBNP, используемые для постановки диагноза СН
2.8.12 Методы измерения концентрации BNP в крови
2.8.13 Диагностические системы для количественного определения NT-proBNP
2.8.14 Диагностические системы для количественного определения proBNP
2.8.15 Стандарты для BNP и NT-proBNP диагностических систем
3 Материалы и методы
3.1 Материалы
3.1.2 Образцы плазмы и сыворотки крови
3.2 Методы
3.2.1 Конъюгирование пептидов с белком-носителем
3.2.2 Иммунизация кроликов и получение поликлональных антител специфичных к BNP человека......................................................................65 (у
3.2.3 Иммунизация мышей и получение линий гибридомных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к BNP
3.2.4 Иммуноферментный и иммунофосфоресцентный анализы
3.2.5 Конъюгирование антител
3.2.5.1 Конъюгирование антител со стабильным хелатом европия
3.2.5.2 Конъюгирование антител с производным биотина
3.2.6 Иммуноферментный анализ
3.2.7 Иммунофосфоресг{ентный анализ
3.2.8 Сэндвич - иммунофосфоресцентный анализ
3.2.9 Сэидвич-иммунофосфоресцентный анализ с направленной сорбцией антител на планшете
3.2.10 ДСН-гелъ-эпектрофорез по методу Лэммли [167]
3.2.11 ДСН-гель-электрофорез в трис-трициновой буферной системе
3.2.12 Иммобилизация антител, либо конъюгата пептида с трансферрииом, на BrCN-активированной сефарозе
3.2.13 Приготовление аффинного носителя с использованием Sulfolink Coupling Gel
3.2.14 Создание молекулярно-генетической конструкции pET-23a(+)-proBNP для экспрессии рекомбинантного proBNP в клетках E. coli
3.2.15 Экспрессия и очистка рекомбинантного proBNP

3.2.16 Алкилирование SH-групп препарата рекомбинантного proBNP под действием йодацеталшда
3.2.17 Экстракция эндогенных BNP и proBNP из образ1{ов плазмы крови с использованием картриджей Sep-Pak С
3.2.18 Хроматографическое разделение белков
3.2.18.1 Гель-филътрацш
3.2.18.2 Ионообменная хроматография
3.2.18.3 Обратно-фазовая хроматография
3.2.19 Масс-спектрометрический анализ рекомбинантного proBNP
3.2.20 Получение Fab -фрагментов антител
3.2.21 Конъюгирование Fab-фрагментов антител 24С5 с синтетическим BNP
4 Результаты и их обсуждение
4.1 Получение поликлональных и моноклональных антител, специфичных к BNP человека
4.1.1 Конъюгирование пептидов, соответствующих различным участкам аминокислотной последовательности BNP человека, с белком-носителем 85 ç
4.1.2 Получение поликлональных антител, специфичных к BNP человека
4.1.3 Получение линий гибридомных клеток, продуцирующих антитела, спегщфичные к BNP человека
4.2 Разработка иммунохимической системы для количественного определения BNP
4.3 Получение и очистка рекомбинантного proBNP, экспрессированного в клетках Escherichia coli (E. coli)...................................................100 '
4.3.1 Создание молекулярно-генетической конструкции pET-23a(+)-proBNP для экспрессии рекомбинантного proBNP в клетках E. coli
4.3.2 Очистка рекомбинантного proBNP
4.4 Анализ BNP-иммунореактивных форм в крови больных с СН
4.5 Исследование иммунохимических свойств эндогенного proBNP
4.6 Создание системы для дифференциальной детекции proBNP
4.7 Исследование стабильности BNP и proBNP
4.8 Разработка нового метода иммуноанализа для количественного определения
нестабильных молекул
4.8.1 Исследование чувствительности повой системы 24C5-Ab-BNP2 к протеопитической деградации BNP
4.9 Влияние протеолитической деградации на определение концентрации BNP в крови больных

представляет собой неструктурированный белок и существует в растворе в виде мономера [83].
2.5.3 Пост-трансляционные модификации молекулы NT-proBNP
Тот факт, что эндогенный предшественник NT-proBNP - pro BNP - является гликопротеином, явился предпосылкой для анализа иммунохимических свойств и эндогенного N-концевого фрагмента молекулы proBNP. Исследования иммунохимических свойств NT-proBNP, экстрагированного из объединенной плазмы пациентов с СН, проводимые в нашей лаборатории, показали наличие гликозилирования в центральной части молекулы NT-proBNP (фрагмент 28-56) [85]. Данные были подтверждены другими учеными, с использованием методов иммуно-аффинной хроматографии и масс-спектрометрического анализа в работе Hammerer-Lercher и соавторов также было показано, что эндогенный NT-proBNP является О-гликопротеином [86].
Проводимый в нашей лаборатории Семеновым А.Г. и соавторами сравнительный анализ иммунохимических свойств эндогенных proBNP и NT-proBNP выявил ряд различий. Было показано, что профили гликозилирования эндогенного proBNP и NT-proBNP отличаются в области, расположенной вблизи сайта расщепления молекулы proBNP (участок 61-76). Фрагмент 61-76 молекулы эндогенного NT-proBNP был доступен для взаимодействия специфических антител, тогда как с фрагментом 61-76 молекулы proBNP специфические антитела практически не взаимодействовали. Гликозилирование участка 61-76 препятствовало взаимодействию специфических антител с рекомбинантным proBNP, экспрессированном в клетках линии НЕК293. Данное наблюдение позволило авторам предположить, что гликозилирование proBNP в области, расположенной вблизи сайта расщепления, может оказывать негативное влияние на процессинг молекулы proBNP, осуществляемый фурином. Анализ процессинга мутантных форм proBNP, экспрессированных в клетках линии НЕК293, в которых остатки Thr-58, Thr-71, Ser-77, Ser-84 были заменены на остатки аланина, выявил негативное влияние гликозилирования остатка Thr-71 на процессинг proBNP. Уровень процессинга Thr71-мутантной формы proBNP в клетках линии ПЕК был приблизительно в 7 раз выше, чем в клетках, экспрессирующих proBNP дикого типа.
Остаток Thr в положении 71 аминокислотной последовательности proBNP характерен исключительно для proBNP человека и приматов и отсутствует у других млекопитающих. Возможно, опосредованное гликозилированием Thr-71 ингибирование процессинга proBNP, является уникальным механизмом регуляции процессинга у