Каротиноиды светособирающих комплексов пурпурной серной бактерии Ectothiorhodospira haloalkaliphila

• Автор: Ашихмин, Александр Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 114 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФОТОТРОФНЫХ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ

1.2 ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПИГМЕНТЫ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ: БХЛ И КАРОТИНОИДЫ

1.2.1 БХл а: структура, функции и биосинтез

1.2.2 Каротиноиды: структура, функции и биосинтез

1.3 ПБК ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ

1.3.1 Реакционный центр

1.3.2 Комплекс ЬШ-ЯС
1.3.3 Комплекс ЬН
1.3.4 Сборка ПБК у пурпурных бактерий
1.3.5 Получение бескаротиноидных ПБК
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ
2.2 ВЫДЕЛЕНИЕ МЕМБРАН И ПБК
2.3 СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.4 ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
2.5 АНАЛИЗ ПИГМЕНТНОГО СОСТАВА
2.6 ВСТРАИВАНИЕ КАРОТИНОИДОВ В ДФА-КОМПЛЕКСЫ ИЗ Есі. ИаІоаІкаІірМІа
2.7 НАГРЕВАНИЕ
2.8 ОБЛУЧЕНИЕ СИНЕ-ЗЕЛЕНЫМ СВЕТОМ
2.9 ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА НА КОМПЛЕКСЫ ЬН
2.10 ОБРАБОТКА КОМПЛЕКСОВ ТРИТОНОМ Х-100, ДС-ЫА И АЦЕТОНОМ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 ПОЛУЧЕНИЕ ОБРАЗЦОВ Есі. Ігаїоаїкаїіркіїа С ИНГИБИРОВАННЫМ БИОСИНТЕЗОМ КАРОТИНОИДОВ
3.1.1 Клетки Есі. Иаіоаїкаїіркіїа с ингибированным биосинтезом каротиноидов.
3.1.2 Мембраны Есі. ИаІоаїкаїірНіїа с разным составом каротиноидов
3.1.3 Комплексы Ы12 из Еск Иаіоаїкаїірігіїа с разным составом каротиноидов..
3.1.4 Свойства ДФА-комплекса ЕН2 из Есі. каїоаїкаїірМІа

3.2 ВСТРАИВАНИЕ КАРОТИНОИДОВ В КОМПЛЕКСЫ LH2 И LH1-RC IN VIVO
ПРИ ВОССТАНОВЛЕНИИ ИХ БИОСИНТЕЗА В КЛЕТКАХ Ect. haloalkaliphila
3.2.1 Восстановленные биосинтеза каротиноидов в ДФА-клетках
(мембранах) Ect. haloalkaliphila
3.2.2 ПБК из клеток Ect. haloalkaliphila с восстановленным биосинтезом каротиноидов
3.2.3 Свойства комплексов LH2 со встроенными in vivo каротиноидами
3.3 ВСТРАИВАНИЕ КАРОТИНОИДОВ IN VITRO В ДФА-КОМПЛЕКСЫ
ИЗ Ect. haloalkaliphila
3.3.1 ДФА-комтексы из Ect. haloalkaliphila со встроенными in vitro каротиноидами
3.3.2 Свойства комплексов LH2 из Ect. haloalkaliphila со встроенными
in vitro каротиноидами
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
LH1 - прицеитровый светособирающий комплекс 1 LH2 - периферический светособирающий комплекс 2 RC - реакционный центр
LH1-RC - «соге»-комплекс или комплекс LH1-RC ПБК - пигмент-белковый комплекс БХл - бактериохлорофилл
БХл800 - бактериохлорофилл с максимумом поглощения при 800 нм БХл850 - бактериохлорофилл с максимумом поглощения при 850 нм ФЕ - фотосинтетическая единица ИК-область - инфракрасная область спектра КД - круговой дихроизм
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ПАГЭ - электрофорез в полиакриламидном геле ДФА - дифениламин
ДФА-образец - образец, выделенный из клеток, выращенных с 71 рМ ДФА
СДС - сопряженная двойная связь
ДМ - п-Додецил ß-D-мальтопиранозид
МБА - N-N'-метилен-бис-акриламид
ПСА — Персульфат аммония
ТЕМЭД - Х,Х,№,1Г-Тетраметилэтилендиамин
Трис — Трис(гидроксиметил)аминометан
Дс-Na- Додецилсульфат натрия
Ale. —Allochromatium
Ect. - Ectothiorhodospira
Ph. - Phaeospirillum
R. - Rhodovulum
Rb. - Rubrivivax
Rba. - Rhodobacter
Rbl. - Rhodoblastus
Rps. - Rhodopseudomonas
Rsp. - Rhodospirillum
T. - Thiocapsa

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ
Объектом исследования была пурпурная серная бактерия Ect. haloalkaliphila штамм 51/7 (АТСС 51935) [Imhoff and Silling, 1996]. Бактерии Ale. minutissimum и Rba. sphaeroides использовали для выделения каротиноидов.
Для культивирования бактерий применялись следующие среды: модифицированная среда Пфеннинга [Imhoff, 1988] для Ect. haloalkaliphila штамм 51/7, среда Ларсена для Ale. minutissimum [Кондратьева, 1963], модифицированная среда Хатнера [De Klerk et al., 1965] для Rba. sphaeroides. Все бактерии росли фотогетеротрофно в анаэробных условиях в стеклянных бутылях (0,5 и 1 л) или микробиологических матрацах (1,5 л) при температуре 26±2°С. В качестве источника света использовали лампы накаливания мощностью 75Вт. Средняя интенсивность освещения была около 1200 люкс.
Для ингибирования биосинтеза каротиноидов в клетках Ect. haloalkaliphila к среде выращивания добавляли водио-спиртовой (1:1) раствор ДФА в концентрациях 17,75; 35,5; 53,25 и 71 рМ (3, 6, 9 и 12 мг на литр среды, соответственно). Продолжительность роста культур составляла 4-6 дней. Клетки, выращенные при концентрации ингибитора 71 рМ, обозначали как ДФА-клетки. Их пересевали дважды для более полного подавления биосинтеза каротиноидов. Осаждение всех клеток проводили центрифугированием при 5000 об/мин на центрифуге К70 D (Германия) с однократным промыванием 0,05М Трис-HCl буфером (pH 8,0) и сразу использовали в экспериментах или хранили при -20°С.
Для восстановления биосинтеза каротиноидов in vivo активные ДФА-клетки Ect. haloalkaliphila дважды отмывали стерильной средой и пересевали на обьгчную среду выращивания (без добавления ингибитора) в 10 стеклянных бутылей емкостью по 0,5 литра. Условия роста и интенсивность освещения описаны выше. Исходньм образцом являлись ДФА-клетки (образец №1, 0 ч роста). В качестве контроля использовали обычные клетки Ect. haloalkaliphila, выращенные без ДФА. Другие образцы отбирали при изменении оптической плотности клеток при 650 нм после их пересева. Всего было получено 10 образцов: №1 (0 ч), №2 (2 ч), №3 (4 ч), №4 (5 ч), №5(10 ч), №6 (17 ч), №7 (25 ч), №8 (54 ч), №9 (110 ч) и №10 (контроль). В скобках указано время роста каждого образца в часах до отбора. Полученные клетки осаждали и сразу использовали в экспериментах или хранили при -20°С.