Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из сперматозоидов: выделение, свойства и роль в их подвижности

• Автор: Элькина, Юлия Леонидовна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 171 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Сперматогенез
Строение сперматозоида
Строение фиброзного слоя
Подвижность сперматозоидов
Механизм движения
Регуляция подвижности
Роль кальция в подвижности
Энергообеспечение движения жгутика сперматозоида
Доказательства важности гликолиза для движения жгутика
Соматическая глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа сперматозоидов (ГАФДс)
Регуляция экспрессии ГАФДс
Активные формы кислорода
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реактивы
Аналитические методы
Определение концентрации белка
Определение ферментативной активности ГАФДс
Определение концентраций реагентов
Определение концентрации перекиси водорода
Определение Кт для субстратов
ЗОБ-электрофорез по методы Лэммли
Голубой нативный гель-электрофорез
Электроперенос белков с последующим иммунохимическим окрашиванием

Изучение влияния различных факторов на подвижность
сперматозоидов
Определение активности ГАФДс в сперматозоидах
Исследование влияния перекиси водорода на подвижность
сперматозоидов и активность ГАФДс
Приготовление пробы для масс-спектрометрического анализа выделенного белка
Дифференциальная сканирующая калориметрия
Метод динамического светорассеяния
Денатурация в 4М гуанидингидрохлориде
Титрование 8Н-групп ГАФД
Окисление перекисью водорода
Т ермоинактивация
Влияние ингибиторов
Получение поликлональных антител на ГАФДс
Твёрдофазный иммуноферментный анализ
Метод электронной микроскопии
Выделение белков
Выделение ГАФД из скелетных мышц кролика
Выделение ГАФДс из сперматозоидов человека
Клонирование рекомбинантных белков
Культивирование продуцентов
Выделение Г АФДс без ]Ч-концевого домена (ё№0АР08)
Выделение ГАФДс с хитинсвязывающим доменом (СйВО-ОАРОБ)
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение ГАФДс из сперматозоидов человека
Трипсинолиз
Выделение ГАФДс из сперматозоидов человека

Чистота препаратов Г АФДс
Анализ выделенного фрагмента ГАФДс методом масс-спектрометрии
(MALDI)
Зависимость активности от pH
Определение молекулярной массы и олигомерного состава ГАФДс
Роль дополнительных цистеиновых остатков в молекуле ГАФДс
Выделение рекомбинантной ГАФДс из клеток E.coli
Экспрессия полноразмерной рекомбинантной ГАФДс
трансформированными клетками E.coli Rosetta 2(DE3)/ pETGAPDS
Выделение ChBD-GAPDS из клеток E.coli Rosetta
2(DE3)/ pETmChBD/dGAPDHS
Г АФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS)
Исследование рекомбинантных форм ГАФДс в сравнении с мышечным
ферментом ГАФД
Каталитические свойства рекомбинантных ферментов
Анализ размеров частиц
Термостабильность рекомбинантных форм ГАФДс
Устойчивость к денатурации
Возможность стабилизации GAPDS дисульфидными связями
Влияние ароматических SH-содержащих соединений на активность
ChBD-GAPDS и ГАФД
Получение поликлональных антител на ГАФДс
Заключение
Исследование роли ГАФДс в подвижности сперматозоидов
Определение активности ГАФДс в сперматозоидах с высокой и низкой
подвижностью
Влияние Н202 и других окислителей на подвижность
сперматозоидов
Заключение
Исследование содержания ГАФДс в сперматозоидах пациентов с астенозооспермией
Рис. 6. Механизм реакции, катализируемой ГАФД. [Stryer L., 1995]